Maklumat

Peranan isopropanol dalam pengasingan plasmid


Dalam pengasingan plasmid, isopropanol digunakan untuk mengubahsuai hanya makromolekul plasmid setelah kita memendapkan semua makromolekul (DNA, RNA, plasmid) menggunakan larutan natrium asetat. Bagaimana ia berlaku? Bagaimana ia tidak mengubah semula setiap makromolekul yang lain?


Dalam prosedur persediaan DNA standard, isopropanol digunakan untuk memendapkan DNA. Asid nukleik tidak larut dalam alkohol, dan banyak atau melekat bersama. Melekat ini dapat ditingkatkan dengan meningkatkan kekuatan ion seperti melalui penambahan natrium asetat.

alkohol sebenarnya tidak menafikan DNA.


Kaedah konvensional untuk pengekstrakan DNA, seperti pemendapan etanol atau sediaan yang menggunakan kit pemurnian komersial, tidak dapat disatukan ke dalam mikrocip kerana memerlukan beberapa langkah pemprosesan langsung. Di samping itu, mereka juga memerlukan peralatan yang besar dan jumlah reagen dan sampel yang tinggi. Resin silika mengelakkan masalah ini melalui penyatuan pada mikrocip, di mana pengekstrakan fasa pepejal memberikan analisis DNA yang tepat pada skala kecil. [3]

Untuk melakukan pemisahan DNA dengan penjerapan silika, sampel (ini mungkin dari sel yang disucikan hingga spesimen tisu) diletakkan di atas kepingan khas dan diproses. Campuran protein, DNA, fosfolipid, dan lain-lain yang dihasilkan, kemudian dijalankan melalui saluran di mana DNA diserap oleh permukaan silika dengan adanya larutan dengan kekuatan ion yang tinggi. Kecekapan penjerapan DNA tertinggi berlaku dengan adanya larutan penyangga dengan pH pada atau di bawah pKa kumpulan silanol permukaan.

Mekanisme di sebalik penjerapan DNA ke silika tidak dapat difahami sepenuhnya, satu penjelasan yang mungkin melibatkan pengurangan cas negatif permukaan silika kerana kekuatan ion penyangga yang tinggi. Penurunan cas permukaan ini menyebabkan penurunan tolakan elektrostatik antara DNA bermuatan negatif dan silika bermuatan negatif. Sementara itu, penyangga juga mengurangkan aktiviti air dengan memformat ion terhidrat. Ini membawa kepada permukaan silika dan DNA menjadi dehidrasi. Keadaan ini membawa kepada keadaan yang sangat baik untuk DNA menyerap ke permukaan silika. [ rujukan diperlukan ]

Penjelasan lebih lanjut mengenai bagaimana DNA mengikat silika didasarkan pada tindakan guanidinium HCl (GuHCl), yang bertindak sebagai chaotrope. Chaotrope mendefinisikan biomolekul dengan mengganggu cengkerang hidrasi di sekelilingnya. Ini membolehkan ion bermuatan positif membentuk jambatan garam antara silika bermuatan negatif dan tulang belakang DNA bercas negatif dalam kepekatan garam tinggi. DNA kemudian boleh dicuci dengan garam dan etanol tinggi, dan akhirnya dielusi dengan garam rendah.

Setelah DNA diserap ke permukaan silika, semua molekul lain melewati lajur. Kemungkinan besar, molekul-molekul ini dihantar ke bahagian sisa pada cip, yang kemudian dapat ditutup menggunakan saluran berpagar atau ruang kawalan tekanan atau voltan. DNA kemudian dicuci untuk mengeluarkan lebihan zarah sisa dari sampel dan kemudian dielusi dari saluran menggunakan penampan elusi untuk proses hiliran selanjutnya. [ rujukan diperlukan ]

Penyelesaian berikut telah diusulkan dan disahkan untuk digunakan dalam proses ini pengikatan DNA: Penyangga pemuatan berasaskan GuHCl Channel Wash: 80% elusi DNA isopropanol: TE pada pH 8.4. [ rujukan diperlukan ]

Kaedah menggunakan manik silika dan resin silika telah dibuat yang dapat mengasingkan molekul DNA untuk penguatan PCR berikutnya. Walau bagaimanapun, kaedah ini mempunyai masalah yang berkaitan. Pertama, manik dan resin sangat berubah-ubah bergantung pada seberapa baik ia dibungkus dan oleh itu sukar dihasilkan semula. Setiap pemuatan saluran mikro boleh menghasilkan jumlah pembungkusan yang berbeza dan dengan itu mengubah jumlah DNA yang diserap ke saluran tersebut. Selanjutnya, kaedah ini menghasilkan proses pembuatan dua langkah.

Struktur silika adalah kaedah pembungkusan bahan yang jauh lebih berkesan kerana ia terukir ke dalam saluran semasa pembuatannya dan oleh itu merupakan hasil proses pembuatan satu langkah melalui litografi lembut. Oleh itu, struktur silika lebih mudah digunakan dalam reka bentuk yang sangat paralel daripada manik atau resin.


Kaedah 'miniprep' satu langkah untuk pengasingan DNA plasmid

Semua kaedah 'miniprep' yang dilaporkan setakat ini untuk pengasingan DNA plasmid melibatkan pelbagai pipetting, ekstraksi, sentrifugasi dan perubahan tiub minifuge. Untuk menyaring sebilangan besar sampel, mereka tidak praktikal, memakan masa dan tidak menjimatkan.

Laporan teknikal di bawah oleh Chowdhury, K. (1991) adalah prosedur 'miniprep' yang sangat pantas, sederhana dan satu langkah. Kualiti dan kuantiti DNA yang diperoleh dengan menggunakan prosedur ini serupa dengan yang diperoleh oleh prosedur Serghini yang biasa digunakan et al. (1) atau Birboim dan Doly (2). Menurut prosedur ini, kultur bakteria diekstraksi secara langsung dengan campuran fenol-kloroform-isoamil alkohol dan DNA yang dibebaskan diendapkan dengan isopropanol. Kaedah ini kini digunakan secara rutin di makmal kami untuk mengasingkan plasmid berukuran hingga 12kb. Penerangan terperinci kaedah ditunjukkan di bawah:

1. Ambil 0.5ml kultur E.coli semalaman dalam tiub mikrofuge. Kami secara rutin mengembangkan sel kami dalam media bakteriologi 'standard 1' yang dibekalkan oleh Merck, Jerman.

2. Masukkan 0.5 ml fenol: kloroform: isoamil alkohol (25: 24: 1). Fenol telah jenuh dengan TE (10mM Tris, 7.5, 1mM EDTA) sebelum dicampurkan dengan kloroform dan isoamil alkohol.

3. Campurkan dengan pusaran pada kelajuan maksimum selama 1 minit. Sebagai alternatif, putar selama 10 saat dan kemudian pindahkan ke pengadun eppendorf atau pemutar yang teratas selama 5 minit.

4. Putar pada 12,000g selama 5 minit. Semasa putaran, sediakan tiub mikrofuge dengan 0.5 ml isopropanol. Selepas putaran, keluarkan dengan teliti kira-kira 0,45 ml fasa berair atas membiarkan interphase tidak terganggu dan tambahkan ke isopropanol. Gaul rata dan segera putar pada 12,000 g selama 5 minit. Penambahan garam dan penyejukan tidak perlu.

5. Tuangkan supernatan, tambahkan 0.5 ml etanol 70% dengan teliti ke sisi tiub, tuangkan. Ulangi pencucian sekali lagi. Vakum kering pelet dan gantung dalam 100ul / ml RNAse). Kira-kira 5-10ul DNA ini kini dapat dibelah dengan enzim larangan yang sesuai untuk dianalisis.


E coli Protokol MiniPrep DNA Plasmid

Pengasingan DNA plasmid dari E coli menggunakan lisis alkali adalah kaedah yang mapan. E coli dengan plasmid dikultur dalam media dengan antibiotik dengan kepadatan sel yang tinggi, dituai, dan kemudian dicairkan dengan larutan SDS / NaOH. Pengasidan cepat menggunakan kalium asetat pekat menyebabkan pemendakan protein dan DNA kromosom. DNA plasmid, yang terlapis, tetap dalam larutan dan dapat ditangkap pada lajur putaran silika. DNA plasmid dicuci dengan larutan etanol dan kemudian dielusi dalam air atau buffer TE.

  • Tiub mikrofuge
  • Penyangga semula (50 mM Tris HCl, pH 8, 10 mM EDTA, 100 & microg / ml RNase A)
  • Penyangga lisis (0.2 N NaOH, 1% SDS)
  • Penimbal peneutralan (Kalium asetat 3/5 M, pH 6)
  • Lajur putaran (Nombor Produk SSC 100-01)
  • Isopropanol
  • Pencuci basuh (70% Etanol)
  • Penyangga Elusi (penyangga air atau TE - 10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA)

Budaya E coli dengan plasmid dalam media LB dengan tekanan selektif antibiotik, semalaman pada shaker pada suhu 37 & degC.

Pellet 1.5 ml kultur bakteria dalam tiub mikrofuge dengan melakukan sentrifugasi selama 2 minit pada 10,000 rpm.

Keluarkan supernatan dan tambahkan 200 & mikol penimbal resuspensi. Untuk menghidupkan semula pelet, anda mungkin perlu melakukan pusaran.

Tambahkan 250 & mikrol penyangga lisis, terbalikkan tiub 10 kali hingga sebati. Penyelesaiannya harus menjadi jelas dan likat.

Tambahkan 350 & mikol penimbal peneutralan, terbalikkan tiub 10 kali atau sehingga mendakan terbentuk. Endapan adalah campuran DNA protein dan kromosom.

Sentrifus tiub selama 10 minit pada 10,000 rpm. Pindahkan supernatan ke tiub mikrofuge dan tambahkan 0.7 isopropanol. Inkubasi pada suhu -20 & degC selama 15 minit.

Pindahkan larutan ke ruang putaran.

Sentrifugasi ruang putaran selama 1 minit pada 7,000 rpm. Buang aliran melalui.

Tambahkan 400 & mikol buffer pencuci dan sentrifugasi selama 1 minit pada 7,000 rpm. Buang aliran melalui. Ulangi langkah ini.

Sentrifuge selama 2 minit tambahan pada 10,000 rpm untuk membuang sisa penyangga pencuci.

Pindahkan lajur ke tiub microfuge yang bersih. Tambahkan 50 & mikol penampan elusi dan empar selama 1 minit pada 10,000 rpm.

Jadual 1: Plasmid yang dielakkan dibaca pada spektrofotometer DeNovix, untuk menentukan kepekatan. Mesin itu diisi dengan air DI.

Nama Contoh Kepekatan (ng / & mikrol) 260/280 260/230
E coli DH5α dengan pSVβ 1143.41 2.06 2.38

Rajah 1: Plasmid terpencil di bawah menjalani pencernaan enzimatik dengan HindIII (bersumber dari NEB) dan dijalankan pada Gel Agarose dengan Ethidium Bromide, di sepanjang dua lorong tangga Lambda yang dicerna (Klik untuk memperbesar gambar).


  • untuk membersihkan DNA plasmid dari E coli sel
  • untuk serpihan DNA khas (panjang gt 200 bp)

Produk dari sekatan perlu sejumlah reagen dikeluarkan dari sekatan sebelumnya. Ini termasuk garam (dari penyangga) dan enzim sekatan. DNA boleh dikeluarkan dan dicuci dari larutan dengan menggunakan kit pemurnian lajur. Berikut adalah penerangan kasar bagaimana kit berfungsi.

Langkah 1: Tingkatkan cas negatif DNA. DNA dikenakan secara negatif kerana tulang belakang fosfat, jadi langkah ini meningkatkan muatan negatif. Dalam kit Qiagen, larutan PB mengandungi guanin klorida, bahan pencuci protein dan denaturant. Larutannya juga sedikit berasid kerana pH yang rendah

Langkah 2: Lekatkan DNA negatif pada resin bermuatan positif. Masukkan produk DNA anda yang bermuatan negatif ke dalam tiub dan sentrifus (biasanya sekitar 14,000 rpm selama 1 minit).

Langkah 3: Basuh DNA untuk mengeluarkan kepingan DNA kecil. Ini dicapai dengan menggunakan buffer Ethanol dan Tris dan dilabel sebagai buffer "PE" dalam kit Qiagen. Penyelesaian ini melarutkan kepingan DNA yang lebih kecil sehingga dapat dielusi dari lajur. Secara amnya anda menambah sejumlah besar barang ini dan memutar lajur (

750mL penyangga PE, putar selama 1 minit).

Langkah 4: Buang EtOH berlebihan. Setelah membuang EtOH dari langkah sebelumnya, putaran lain adalah baik untuk membuang semua EtOH dari lajur dan DNA sehingga tidak masuk ke produk akhir yang dielusi. Putar selama kira-kira 12 minit pada 14,000 rpm).

Langkah 5: Elusi. Elution buffer adalah Tris buffer dengan sedikit EDTA pada pH 8-8.5. EDTA mengikat kation divalen, terutamanya magnesium (Mg2 +). Tris mempunyai proton labil dengan pKa 8,30 (pada 20 ° C ini menurun kira-kira 0,03 unit per darjah Celsius kenaikan suhu). Tris sering digunakan semasa bekerja dengan asid nukleik. Tris adalah penyangga yang berkesan untuk penyelesaian asas yang sedikit, yang menjadikan DNA tidak terprotonasi dan larut dalam air. Ion-ion ini adalah faktor bersama bagi banyak enzim Magnesium adalah faktor bersama bagi banyak enzim pengubah DNA. Tris beracun untuk sel mamalia, dan bertindak balas dengan kuat dengan elektrod pH. Ini adalah amina utama, dan dengan itu dapat bertindak balas dengan aldehid.


A. PENJUALAN-KELUAR

Kerpasan protein dengan kepekatan garam yang tinggi.

KIT DANAGENE SALIVA

Kit ini membolehkan anda mengasingkan DNA dari sampel air liur pelajar untuk mendapatkan DNA berkualiti untuk digunakan dalam PCR.

& gt Kit merangkumi:
Larutan larutan, larutan pemendakan protein dan larutan penghidratan DNA.
& gt Anda perlukan:
M icropipettes, microtubes, microcentrifuge, isopropanol dan 70% etanol.

0603.4 50 orang pelajar
0603.41 160 pelajar

KIT DNA DARAH DANAGENE

Kit ini membolehkan anda mengasingkan DNA dari sampel darah untuk mendapatkan DNA berkualiti untuk digunakan dalam PCR.

& gt Kit merangkumi:
Penyelesaian RBC, larutan lisis, larutan pemendakan protein dan larutan penghidratan DNA.
& gt Anda perlukan:
Micropipettes, microtubes, microcentrifuge, isopropanol dan 70% etanol.

0601 100 ml / darah
0602 200 ml / darah

KIT DNA TANAMAN DANAGENE

Kit ini membolehkan anda mengasingkan DNA dari sampel tumbuhan yang berbeza untuk mendapatkan DNA berkualiti untuk digunakan dalam PCR.

& gt Kit merangkumi:
Penyangga pengekstrakan, larutan lisis, RNAse, larutan PVP, larutan pemendakan protein dan larutan penghidratan DNA.
& gt Anda perlukan:
Micropipettes, microtubes, microcentrifuge, isopropanol dan 70% etanol.

0604.1 50 petikan
0604.2 200 pengekstrakan


Plasmid membantu bakteria untuk bertahan dari tekanan

Plasmid mengandungi hanya beberapa gen, tetapi ia memberi perbezaan besar kepada bakteria inang mereka. Gen biasanya tidak penting untuk kelangsungan hidup bakteria sehari-hari - sebaliknya, ia membantu bakteria untuk mengatasi situasi tekanan kadang-kadang. Sebagai contoh, banyak plasmid mengandungi gen yang, ketika dinyatakan, menjadikan bakteria inang tahan terhadap antibiotik (jadi tidak akan mati ketika dirawat dengan antibiotik tersebut). Plasmid lain mengandungi gen yang membantu inang mencerna bahan yang tidak biasa atau membunuh jenis bakteria lain.


Petua untuk pemeriksaan biru-putih

  • Gunakan kawalan yang baik: Ubah plasmid tulang belakang tanpa sisipan. Semua jajahan di plat ini mestilah berwarna biru, menunjukkan bahawa IPTG dan x-gal anda berfungsi sebagaimana mestinya.
  • Jangan tergesa-gesa prosesnya: Penting untuk memberi plat anda masa yang cukup untuk sebarang β-galactosidase utuh dinyatakan dan memproses x-gal menjadi pigmen biru (16-20 jam). Pinggan dengan hanya tanah jajahan putih sangat mencurigakan!
  • Sejukkan pinggan anda: Meletakkan plat pada suhu 4C selama beberapa jam setelah inkubasi semalaman awal meningkatkan pemendapan pigmen, meningkatkan warna biru koloni negatif, dan memungkinkan pembezaan yang lebih baik antara koloni biru dan putih.
  • Berhati-hati dalam membuat pinggan anda: X-gal sensitif terhadap cahaya dan suhu dan perlu ditambahkan ke media selepas melakukan autoklaf. Sekiranya tersebar di atas pinggan yang telah dibuat sebelumnya, pastikan ia diedarkan secara merata dan biarkan masa pengeringan yang mencukupi sebelum digunakan.
  • Hati-hati dengan positif palsu: Pemeriksaan putih-biru hanya menunjukkan kehadiran sisipan AN, tidak semestinya sisipan ANDA. Sebarang artifak pengklonan yang mengganggu DNA α-peptida juga akan membawa kepada koloni putih.
  • Dan juga negatif palsu: Ini jarang berlaku, tetapi jika serpihan kecil dimasukkan ke dalam bingkai, pembacaan boleh menyebabkan enzim β-galaktosidase berfungsi dan koloni biru. Pemeriksaan putih-biru adalah kaedah yang baik untuk menyempitkan calon untuk analisis yang lebih spesifik, seperti PCR atau had sekatan.
  • Pastikan anda menggunakan regangan E. coli yang betul (iaitu mengandungi mutasi lacZΔM15): XL1-Blue, DH5α, DH10B, JM109, STBL4, JM110, dan Top10 adalah beberapa contoh.
  • Pastikan anda menggunakan plasmid yang betul (iaitu mengandungi pengklonan α-pelengkap MCS): pGEM-T, pUC18 dan pUC19, dan pBluescript adalah beberapa vektor biasa.

Pemeriksaan putih-biru sahaja - proses penyaringan. Ia tidak hanya memilih sel-sel yang telah mengambil plasmid dan dengan itu harus digunakan bersama dengan kaedah pemilihan. Menggabungkan pemilihan dan penyaringan memastikan bahawa koloni putih yang anda lihat berwarna putih kerana pengklonan yang berjaya dan bukan kerana sel gagal mengambil plasid pelengkap α. Dengan cara ini anda dapat dengan cepat dan mudah mengenal pasti koloni yang bukan sahaja mempunyai plasmid anda (ketahanan terhadap antibiotik), tetapi juga mengesahkan bahawa plasmid tersebut mempunyai sisipan anda (pemeriksaan biru-putih).


DNA miniprep oleh Alkaline Lysis (aktiviti)

Setelah DNA diperkenalkan dan dibawa dalam bakteria, kami ingin mengasingkan DNA itu lagi untuk manipulasi selanjutnya. Untuk melakukannya, bakteria yang mengandungi plasmid minat ditanam dalam kultur cair kaldu kaya nutrien yang terbuat dari ekstrak ragi yang disebut Luria-Bertani Broth ( LB ). Bakteria kultur ini ditanam sehingga kepekatannya tinggi sepanjang malam. Mereka dituai melalui sentrifugasi dan kuahnya dikeluarkan. Pelet bakteria yang dihasilkan disusukan semula dalam buffer fisiologi yang mengandungi chelator EDTA. A chelator adalah bahan kimia yang menghilangkan kation divalen seperti Ca 2+ atau Mg 2+ dari larutan. Ini penting kerana kation divalen diperlukan agar enzim pencernaan DNA aktif. Dengan menggelapkan ion, DNA yang akhirnya ingin kita bersihkan akan selamat dari degradasi.

Selepas pembangkit semula bakteria, larutan alkali NaOH 0.1N dicampurkan ke dalam campuran bakteria. Penyelesaian ini juga mengandungi detergen ion yang disebut sodium dodecyl sulfate ( SDS ) yang membantu dalam denaturasi protein dan mengganggu interaksi mereka dengan DNA. Campuran menjadi likat ketika bakteria terbuka dan kandungannya bocor ke dalam larutan. Penyelesaian asas ini kemudian dinetralkan dengan buffer asetat kalium pada pH5.5. Semasa larutan bercampur, pH menghampiri 7 dan kalium berinteraksi dengan SDS untuk menyebabkan pemendakan DNA dan protein kromosom genom. Untuk memisahkan endapan dari larutan, campuran disentrifugasi pada kecepatan tinggi untuk meletupkan DNA genom dan protein. The supernantant , atau penyelesaian, dipindahkan ke lajur yang berisi a membran silika . Dalam keadaan garam tinggi, DNA melekat pada kaca atau silika. Dengan melewati larutan melalui lajur ini, DNA plasmid dalam supernatan terperangkap ke membran silika dan dikeluarkan dari larutan. Pencucian tambahan digunakan untuk menghilangkan bahan cemar sesat dan membuang garam yang berlebihan. DNA plasmid akhirnya dikeluarkan dari lajur melalui elusi oleh penyangga garam rendah. Penyangga garam rendah ini ialah Tris pH 8 dengan EDTA ( TE ). DNA plasmid dapat disimpan dengan stabil dalam buffer TE di dalam peti sejuk untuk jangka masa yang panjang.


Transformasi DNA plasmid menjadi E. coli menggunakan kaedah kejutan haba

Transformasi DNA plasmid menjadi E. coli menggunakan kaedah kejutan haba adalah teknik asas biologi molekul. Ini terdiri daripada memasukkan produk plasmid atau ligasi asing ke dalam bakteria. Protokol video ini menerangkan kaedah transformasi tradisional menggunakan bakteria berkemampuan kimia dari Genlantis yang tersedia secara komersial. Setelah pengeraman sebentar di dalam ais, campuran bakteria dan DNA yang kompeten secara kimia ditempatkan pada suhu 42 darjah C selama 45 saat (kejutan panas) dan kemudian dimasukkan kembali ke dalam ais. Media SOC ditambahkan dan sel yang diubah diinkubasi pada suhu 37 darjah C selama 30 minit dengan pergolakan. Untuk memastikan pengasingan koloni tanpa mengira kecekapan transformasi, dua kuantiti bakteria yang diubah disalut. Protokol tradisional ini dapat digunakan dengan jayanya untuk mengubah bakteria kompeten yang tersedia secara komersial. Turbocells dari Genlantis juga dapat digunakan dalam protokol transformasi 3 minit novel, yang dijelaskan dalam manual arahan.


Tonton videonya: What is a Plasmid? - Plasmids 101 (Disember 2021).