Maklumat

6: Pengangkutan dan Kinetik - Biologi


  • 6A: Penyebaran Pasif dan Fasilitasi
    Bab ini akan membincangkan proses penyebaran. Pertama, persamaan penyebaran akan dikeluarkan untuk kes yang tidak melibatkan reseptor pengikat. Selanjutnya kita akan memperoleh persamaan untuk resapan yang dimediasi reseptor merentasi membran - difusi yang difasilitasi. Kami akan menangani keadaan di mana zat terlarut mesti dibawa ke arah kecerunan kepekatan, suatu proses yang disebut pengangkutan aktif.
    • A1. Difusi Ringkas
    • A2. Difusi yang Dipudahkan
    • A3. Penerima dalam Difusi Fasilitasi
    • A4. Pori Membran
    • A5. Persimpangan Sel - TBA
    • A6. Pautan dan Rujukan
  • 6B: Kinetik Tindakbalas yang Dimangkinkan Mudah dan Enzim
    tuliskan persamaan kimia dan pembezaan yang sesuai untuk kadar kehilangan reaktan atau kemunculan produk untuk pesanan pertama, pesanan pertama palsu, pesanan kedua, tindak balas pesanan pertama terbalik melukis dan mentafsirkan grafik untuk persamaan kadar bersepadu (menunjukkan tindak balas atau kepekatan produk sebagai fungsi masa) dan persamaan kadar awal (menunjukkan halaju awal vo sebagai fungsi reaktan;
    • B1: Reaksi Langkah Tunggal
    • B2. Reaksi Pelbagai Langkah
    • B3. Tindak Balas Enzim yang Seimbangkan dengan Cepat
    • B4. Reaksi yang Dikatalisa Enzim yang Mantap
    • B5. Analisis Persamaan Michaelis-Menten Umum
    • B6. Reaksi yang Dikatalisis Enzim yang Lebih Rumit
    • B7. Makna Pemalar Kinetik
    • B8. Penentuan Eksperimen Parameter Kinetik
  • 6C: Perencatan Enzim
    Oleh kerana struktur memediasi fungsi, apa sahaja yang secara signifikan akan mengubah struktur enzim akan menghalang aktiviti enzim. Oleh itu, pH dan suhu tinggi yang melampau, yang semuanya dapat mengubah enzim, akan menghambat enzim dengan cara yang tidak dapat dipulihkan, kecuali jika dapat dilipat dengan baik. Sebagai alternatif kita boleh menambahkan molekul kecil yang berinteraksi secara tidak kovalen dengan enzim untuk mengubah konformasinya atau secara langsung mencegah pengikatan substrat.
    • C1: Inhibisi Kovalen yang Tidak Dapat Diubah
    • C2: Inhibisi Persaingan
    • C3: Inhibisi Tidak Bersaing
    • C4: Inhibisi Tidak Bersaing dan Campuran
    • C5. Perencatan Enzim di Vivo
    • C6. Agonis dan Antagonis Pengikatan Ligand kepada Penerima - Satu Sambungan
    • C7. Perencatan oleh Perubahan Suhu dan pH
    • C8. Pautan dan Rujukan
  • 6D: Enzim Lebih rumit
    Pada hakikatnya, banyak enzim mempunyai lebih daripada satu substrat (A, B) dan lebih daripada satu produk (P, Q). Sebagai contoh, enzim alkohol dehidrogenase memangkinkan pengoksidaan etanol dengan NAD (agen pengoksidaan biologi) untuk membentuk asetaldehid dan NADH.
    • D1. Mekanisme Urutan Berbilang Substrat
    • D2: Mekanisme Ping-Pong Berbilang Substrat
    • D3: Inhibitor dalam Reaksi Multi-substrat
    • D4. Enzim Allosterik
    • D5. Integrasi Pengikatan, Difusi dan Kinetik
    • D6. Pautan dan Rujukan
  • 6E: Masalah Kerja Rumah - Modul Pembelajaran Kesusasteraan: Enzyme Inhibition 1 - KCAT
    • Masalah Kerja Rumah - Modul Pembelajaran Kesusasteraan Inhibisi Enzim - KAT: KUNCI

Pengangkutan Molekul merentasi Membran Sel

Perkara berikut menunjukkan lima proses yang terlibat dalam pengangkutan molekul melintasi membran sel. Prosesnya adalah: 1. Difusi Pasif 2. Difusi Fasilitasi 3. Pengangkutan Aktif 4. Translokasi Berkumpulan 5. Pengangkutan Ion melalui Ionofor.

Proses # 1. Difusi Pasif:

Dengan penyebaran pasif, molekul bergerak melintasi membran tanpa berinteraksi dengan protein pembawa tertentu dalam membran sel. Pergerakan selalu dari kepekatan yang lebih tinggi ke yang lebih rendah dan pergerakan seperti itu berterusan sehingga kepekatan zat terlarut di kedua sisi membran adalah sama.

Pada kepekatan itu, keseimbangan dicapai. Walau bagaimanapun, jika molekul di dalam sel dimakan, pergerakan ke dalam berterusan, mis. oksigen yang dibawa ke dalam sel terus dimakan untuk pernafasan, atau karbon dioksida untuk fotosintesis. Molekul-molekul yang dapat masuk ke dalam sel melalui penyebaran pasif umumnya berukuran kecil dan tidak bersifat polar.

Proses # 2. Difusi Terfasilitasi:

Proses pengangkutan ini berbeza dengan penyebaran pasif kerana mempunyai keperluan protein pengangkut atau pembawa. Protein ini - juga dikenali sebagai permease - terletak di membran dan ia dipercayai menjangkau seluruh lebar lipid-bilayer.

Protein transporter khusus untuk jenis molekul tertentu, atau kadang-kadang sekumpulan molekul yang berkait rapat. Fungsi pengangkut adalah untuk mengikat molekul yang dapat diangkut di satu sisi membran dan melepaskannya di sisi lain. Agaknya, fungsi ini dikaitkan dengan perubahan konformasi molekul protein transporter.

Ini ditunjukkan secara skematik dalam Rajah 8.81:

Tiga jenis protein transporter telah dikenali. Ini adalah uniporters yang mengangkut hanya satu jenis molekul dalam satu arah, sama ada dari luar ke dalam atau ke arah yang bertentangan. Symporters dapat mengangkut dua jenis molekul dalam arah yang sama dan anti-kuli membawa dua molekul yang berlainan dalam arah yang berlawanan.

Fungsi ketiga jenis pengangkut ini ditunjukkan secara skematik pada Gambar 8.82:

Protein pengangkutan menyerupai enzim hingga tahap tertentu. Kedua-dua pengangkut dan enzim menunjukkan kekhususan atau selektiviti mengenai jenis molekul atau sekumpulan molekul yang dengannya mereka dapat berinteraksi. Juga, kedua-duanya menunjukkan kinetik saturasi yang bermaksud bahawa dengan peningkatan kepekatan molekul secara beransur-ansur dengan mereka bertindak balas, titik tepu dicapai, di mana peningkatan selanjutnya mengakibatkan tidak ada peningkatan kecepatan. Tetapi ada satu perbezaan penting. Walaupun enzim mengubah molekul substrat menjadi produk, protein transporter memberikan molekul yang tidak berubah melintasi membran.

Kinetik tepu yang diperhatikan sekiranya difusi yang difasilitasi tidak hadir dalam penyebaran pasif. Dalam penyebaran pasif, faktor penentu adalah kecerunan kepekatan dan kadar pengangkutan meningkat dengan perbezaan kepekatan molekul yang dapat dipindahkan pada kedua sisi membran.

Apabila keseimbangan dicapai, kepekatannya sama pada dua sisi. Sekiranya difusi difasilitasi, peningkatan kepekatan molekul yang dapat diangkut di satu sisi membran juga mengakibatkan peningkatan laju pengangkutan, hingga semua protein transporter tepu dengan molekul tersebut.

Pada tahap ini, kadar penyebaran adalah maksimum dan kadar ini dikekalkan sehingga kepekatan di kedua-dua sisi sama. Oleh itu, dengan penyebaran pasif dan difusi yang difasilitasi, kepekatan akhir adalah sama. Tetapi kerana difusi yang difasilitasi adalah proses yang lebih cepat, keseimbangan dicapai dengan lebih cepat.

Ini ditunjukkan secara gambarajah dalam Rajah 8.83:

Proses # 3. Pengangkutan Aktif:

Pengangkutan aktif molekul nutrien pada dasarnya berbeza dari proses penyebaran, sama ada pasif atau difasilitasi. Dalam proses aktif, pengangkutan merentasi membran berlaku terhadap kecerunan kepekatan iaitu dari kepekatan yang lebih rendah hingga kepekatan zat terlarut yang lebih tinggi. Pengangkutan seperti itu hanya boleh berlaku dengan perbelanjaan tenaga. Dengan kata lain, pengangkutan aktif selalu merupakan proses yang memakan tenaga (endergonik). Dalam sistem biologi, pengangkutan aktif selalunya jauh lebih penting daripada proses penyebaran.

Sebab mengapa pengangkutan aktif molekul zat terlarut dari kepekatan yang lebih rendah ke yang lebih tinggi memerlukan input tenaga dapat difahami dari prinsip termodinamik. Kerana peningkatan kepekatan molekul zat terlarut dalam sel, tenaga bebas (G) meningkat kerana entropi (S) menurun.

Hubungan antara perubahan tenaga bebas (∆G) dan entropi dinyatakan oleh persamaan, ∆G = ∆H & # 8211 TΔS, di mana H mewakili entalpi (jumlah tenaga sistem) dan T bermaksud suhu mutlak. Apabila kepekatan meningkat dalam sel, entropi jatuh kerana molekul zat terlarut didekatkan antara satu sama lain sehingga kehilangan kebebasan bergerak.

Faktor lain, iaitu H dan T, tetap sama, penurunan S bermaksud peningkatan nilai G iaitu tenaga bebas. Oleh itu, pengangkutan aktif membawa kepada peningkatan tenaga bebas (G). Proses yang membawa kepada peningkatan tenaga bebas tidak boleh berlaku secara spontan dan hanya boleh berlaku melalui input tenaga. Tenaga ini dibekalkan oleh hidrolisis ATP atau oleh daya motif proton (PMF) yang dihasilkan oleh kepekatan proton yang tidak sama (H +) di kedua-dua sisi membran.

Kuantiti tenaga (dinyatakan dalam kalori) yang diperlukan dalam pengangkutan aktif dapat dikira menggunakan persamaan AG = RT Dalam C2/ C1, di mana ∆G mewakili perbezaan tenaga bebas, R pemalar gas (= 1.98), T suhu dinyatakan sebagai suhu mutlak (273 + ° C), Dalam logaritma semula jadi (2.303 x log10), C2 kepekatan zat terlarut di dalam sel dan Q kepekatan zat terlarut di luar.

Sekarang, dalam pengangkutan aktif C2 lebih besar daripada C1 dan, oleh itu, faktor C2/ C1 selalu bilangan bulat positif. Ini bermaksud bahawa ΔG mempunyai nilai positif. Sistem yang mempunyai ∆G positif tidak dapat beroperasi secara spontan. Dari persamaan di atas, kuantiti tenaga yang diperlukan untuk mengangkut 1 mol zat terlarut tidak berion melintasi membran yang telap ke molekul zat terlarut, dari kepekatan 0.001 M hingga 0.1 M pada suhu tertentu, katakan 30 ° C , boleh dikira

∆G = RT Dalam C2/ C1 = 1.98 x (273 + 30) x 2.303 log (0.1 / 0.001)

Untuk molekul bermuatan, iaitu ion dan radikal, persamaan di atas harus diubah untuk mengakomodasi kecerunan lain selain kecerunan kepekatan, iaitu kecerunan elektro-potensi, kerana yang terakhir juga menyumbang kepada perubahan tenaga bebas dalam sistem.

Seperti difusi yang difasilitasi, pengangkutan aktif juga melibatkan mediasi protein transporter yang terdapat dalam membran sel. Protein ini mungkin berfungsi dengan cara yang sama seperti yang terlibat dalam penyebaran yang difasilitasi. Mereka, kerana mempunyai pertalian tinggi untuk zat terlarut yang dapat diangkut, bergabung dengannya dan dengan itu mengalami perubahan konformasi kehilangan pertalian bagi molekul zat terlarut yang mengakibatkan pembebasan di sisi lain membran.

Apabila zat terlarut tertentu harus diangkut secara aktif menggunakan kekuatan motif proton, protein transporter mengikat kedua molekul H + dan zat terlarut. Salah satu contoh pengangkutan jenis ini disediakan oleh pengambilan laktosa oleh E. coli. Pengangkut laktosa (laktosa-permease) mengikat molekul H + dan laktosa dan mengangkutnya secara serentak ke dalam sel (symport).

Contoh lain dijumpai dalam kes pengangkutan glutamat di E. coli. Pengangkut dalam kes ini mengikat glutamat di luar dan mengangkutnya ke dalam, dan mengikat H + ke dalam dan mengusir mereka di luar (anti-port), sehingga pengambilan glutamat dihubungkan dengan pengusiran H +.

(i) Pengangkutan aktif laktosa di E coli:

Pengangkutan laktosa di E. coli adalah sistem yang dapat diinduksi. Bakteria yang tumbuh tanpa laktosa tidak dapat mengangkut gula ke dalam sel. Tetapi apabila laktosa ditambahkan dalam media menggantikan gula lain (seperti glukosa), bakteria dengan cepat mengembangkan kemampuan untuk mengangkut laktosa kerana sintesis baru lendosa permease. Enzim ini adalah protein integral membran yang bertindak sebagai pengangkut laktosa.

Telah diperhatikan bahawa pengangkutan laktosa ke dalam sel disertai oleh kenaikan nilai pH medium luaran akibat penipisan ion H +. Menurut teori chemiosmotic, pengoksidaan substrat pernafasan menyebabkan pengusiran H + keluar dari sel mewujudkan kecerunan proton melintasi membran sel yang digunakan untuk sintesis ATP. Kecerunan proton yang dihasilkan digunakan oleh E. coli juga untuk pengambilan laktosa.

Molekul permease laktosa mengandungi laman web tertentu untuk mengikat laktosa dan satu lagi laman web untuk mengikat H +, dan kedua-dua tapak mesti dilekatkan agar enzim berfungsi. Protein permease merentasi membran dan ia mengikat laktosa dan proton pada wajah luar.

Pengikatan ini menyebabkan perubahan konformasi protein dan mengakibatkan pelepasan kedua-dua laktosa dan H + di dalam sel (symport). Selepas pelepasan, permease kembali ke penyesuaian asalnya, membolehkan kitaran diulang. Kecerunan proton dikekalkan oleh ekspirasi pernafasan H +.

Fungsi permease laktosa di E. coli ditunjukkan secara gambarajah dalam Rajah 8.84:

(ii) Pengangkutan Na + dan K + :

Dalam kebanyakan organisma biologi, kepekatan intraselular K + lebih tinggi daripada medium luaran. Berbalik adalah keadaan sekiranya Na +. Keupayaan sel untuk mengekalkan kepekatan pembezaan Na + dan K + berbanding medium luaran didapati disebabkan oleh enzim, Na + K + -ATPase yang terdapat dalam membran.

Enzim ini memerlukan kehadiran Na + di dalam sel dan K + di luar untuk menjadi berfungsi. Ia mempunyai laman web pengikat ATP dan laman web lain untuk mengikat Na + ke arah dalamannya. Pada bahagian luarnya, enzim mempunyai tapak pengikat K +. Telah dinyatakan bahawa ketika enzim mengikat Na + dan ATP, ia mendorong hidrolisis ATP yang mengakibatkan perubahan konformasi.

Konformasi enzim yang diubah kehilangan pertalian untuk Na + yang dilepaskan di luar tetapi, pada masa yang sama konformasi yang diubah mengembangkan pertalian untuk K + yang diangkut di dalam sel. Pengikatan K + dengan enzim menyebabkan depososforilasi (pelepasan fosfat anorganik) yang mengembalikan penyesuaian semula protein enzim dan membolehkan pengikatan Na + dan ATP. NaPK Na + K + & # 8211 yang disucikan adalah glikoprotein yang terdiri daripada dua subunit besar dan dua kecil.

Subunit kecil mempunyai rantai sisi karbohidrat di bahagian luarnya (Gamb. 8.85):

Pengusiran aktif Na + oleh aktiviti Na + K + -ATPase menghasilkan kecerunan Na + melintasi membran yang digunakan oleh banyak mikroorganisma untuk pengambilan aktif asid amino dan gula. Pengangkutan ke dalam sebatian ini disertai dengan pengambilan Na + secara serentak yang bergerak ke arah kecerunan kepekatan, sedangkan asid amino dan gula bergerak melawan kecerunan kepekatan iaitu dari kepekatan yang lebih rendah (luar) ke kepekatan (dalam) yang lebih tinggi.

Kepekatan Na + di luar yang lebih tinggi dikekalkan oleh pengusiran aktif Na + melalui aktiviti Na + K + -ATPase. Protein transporter khusus untuk asid amino atau gula mempunyai dua tapak pengikat, satu untuk Na + dan satu lagi untuk asid amino atau gula. Hanya apabila kedua-dua laman web ini dihuni oleh ligan masing-masing, pengangkutan boleh berlaku (symport).

Proses # 4. Translokasi Berkumpulan:

Translokasi kumpulan adalah sejenis pengangkutan di mana molekul yang dapat dipindahkan diubah secara kimia menjadi bentuk yang tidak dapat ditembus semasa melintasi membran sitoplasma. Kerana transformasi, molekul terperangkap dalam sitoplasma dan tidak dapat melepaskan diri.

Contoh translokasi kumpulan yang paling terkenal ialah sistem phosphotransferase (PTS) yang berlaku dalam pelbagai jenis bakteria untuk pengangkutan gula. Sistem ini didapati beroperasi di E. coli, Salmonella, Vibrio, Staphylococcus, Clostridium, Fusobacterium dll. Walau bagaimanapun, dalam beberapa bakteria, seperti Azotobacter, Mycobacterium, Nocardia dan Micrococcus, PTS tidak ada.

Sekurang-kurangnya tiga protein yang berbeza didapati terlibat dalam sistem translokasi kumpulan gula yang berbeza. Untuk beberapa gula, seperti glukosa, protein tambahan diperlukan. Protein ini adalah enzim I, enzim II dan protein kecil yang tahan panas, yang disebut HPr. Protein tambahan untuk glukosa adalah enzim III.

Semua protein ini kecuali enzim II adalah sitoplasma. Enzim II adalah protein membran-integral. Ia juga berbeza untuk pengangkutan gula yang berbeza, sementara enzim I dan HPr adalah biasa untuk semua sistem pengangkutan gula. Protein ini berfungsi sebagai rangkaian pembawa di PTS.

Pengoperasian sistem translokasi ini (PTS) dimulakan dengan pemindahan kumpulan fosfat tenaga tinggi asid piruvik fosfenol (PEP) ke enzim I (E-I) dalam sitoplasma sel bakteria. Seterusnya, kumpulan fosfat E-I yang terfosforilasi (E-I-P) dipindahkan ke HPr, juga protein sitoplasma, untuk menghasilkan HPr- (P). Kumpulan fosfat kemudian dipindahkan ke enzim II yang terikat membran (E-II) secara langsung, atau, dalam hal pengangkutan glukosa, melalui enzim III (E-III).

Akhirnya, E-II atau E-III yang terfosforilasi menyumbangkan kumpulan fosfatnya kepada gula yang diangkut dan gula dilepaskan dalam sitoplasma sebagai ester fosfatnya. Sebagai contoh, sekiranya glukosa, ia adalah glukosa 6-fosfat. Fosfat gula bermuatan negatif dihalang melarikan diri melalui membran sitoplasma.

Sekiranya manitol, bentuk fosforilasi di mana ia dilepaskan adalah manitol-1-fosfat. Oleh kerana selaput pada umumnya tidak tahan terhadap molekul bermuatan, PTS dapat menyebabkan kepekatan gula fosfat yang tinggi dalam sitoplasma, sedangkan kepekatan gula jauh lebih rendah pada medium luaran. Oleh itu, dalam PTS, gula ditukar dengan kecerunan kepekatan. Oleh itu, ini adalah jenis pengangkutan aktif di mana tenaga dibekalkan oleh sebatian PEP yang kaya dengan tenaga.

Enzim II adalah protein membran-integral yang khusus untuk gula yang diangkut. Banyak jenis gula boleh diangkut oleh PTS. Ini termasuk glukosa, galaktosa, fruktosa, pentosa & # 8217s, alkohol gula seperti manitol, ribitol, dan galaktosida. Untuk setiap sebatian ini, nampaknya terdapat enzim II yang berbeza.

Protein haba kecil (HPr) PTS mempunyai berat molekul 9,400 Daltons. Apabila HPr difosforilasi oleh E-I

(P), kumpulan fosfat dilampirkan melalui atom-N residu histidin HPr.

Perwakilan skematik rantai pembawa dalam pengoperasian sistem bakteria fosfotransferase ditunjukkan dalam Rajah 8.86:

Proses # 5. Pengangkutan Ion melalui Ionofor:

Sebatian antibiotik tertentu dihuraikan oleh mikro

nisma boleh bertindak sebagai ionofor apabila disatukan ke dalam membran. Ejen ini, bagaimanapun, bukan komponen pengangkutan semula jadi membran. Dua daripada agen tersebut adalah valinomycin yang dihasilkan oleh spesies Streptomyces dan gramicidin yang dihasilkan oleh Bacillus brevis. Pengangkutan ion oleh ionofor ini telah dikaji dengan baik di mitokondria terpencil.

Valinomycin adalah molekul siklik yang terdiri daripada 12 molekul bergantian D- atau L-valine dan L-laktat atau D-hydroxyisovalerate. Struktur valinomycin ditunjukkan dalam Rajah 8.87A. Molekul valinomisin bulat mempunyai pinggiran hidrofobik yang sesuai dengan lapisan dua hidrbobobik lipid membran di mana valinomisin dimasukkan.

Inti pusat molekul valinomycin adalah hidrofilik dan bercas negatif. Inti bercas negatif dapat mengikat kation bermuatan positif.Valinomisin secara khusus dapat mengangkut K +, kerana ukurannya sedemikian rupa sehingga pas di inti tengah. Na + atau Li + kurang diangkut oleh valinomycin, kerana ukurannya tidak sepadan dengan ukuran inti pusat molekul.

Sebatian antibiotik lain, non-aktin, juga mempunyai struktur bulat dan diketahui mengangkut K + merentasi membran mitokondria.

Strukturnya ditunjukkan dalam Rajah 8.87B:

Menurut satu hipotesis, valinomycin bertindak sebagai pembawa dan molekulnya membolak-balik melintasi membran lipid membran yang mengangkut K + melintasi membran.

Cas positif ion ditutup dengan inti molekul valinomycin yang bercas negatif (Rajah 8.88):

Gramicidin A adalah antibiotik polipeptida yang terdiri daripada rantai linear 15 residu asid amino. Dua molekul gramicidin bergabung dengan ikatan-H di hujung terminal N membentuk heliks yang merangkumi membran. Melalui saluran pusat heliks, kation monovalen seperti H +, NH4 +, K +, Na + dan Li + mungkin diangkut ke dalam sel.

Urutan keutamaan ion yang dapat diangkut adalah seperti yang disebutkan iaitu H + mempunyai keutamaan tertinggi dan Li + terendah.

Struktur molekul gramicidin A dan heliks postulat yang dibentuk oleh sepasang molekul gramicidin dalam lapisan lipid membran ditunjukkan pada Rajah 8.89 A dan B:


PENGENALAN

Reseptor 6-fosfat Mannose (M6PRs) menyampaikan hidrolase asid yang baru disintesis ke laluan endosit dan kemudian kembali ke trans-Golgi network (TGN Storrie et al., 1984 Brown et al., 1986 Duncan dan Kornfeld, 1988 Kornfeld dan Mellman, 1989). Laluan yang diambil oleh kompleks hidrolase asid M6PR dalam laluan endosit belum ditentukan dengan jelas tetapi, dari kajian pengedaran M6PR keadaan tetap, secara amnya dipercayai bahawa reseptor ini menumpukan perhatian pada petak di endosom-ke-lisosom laluan, yang telah dipanggil endosom prelysosom atau akhir (Griffiths et al., 1988,1990 Kornfeld dan Mellman, 1989). Kompartemen prelysosomal ini kurang baik untuk reseptor kitar semula seperti reseptor transferrin (TR) tetapi boleh dilabelkan dengan probe fasa bendalir, yang dihantar dengan berkesan ke lisosom (Griffiths et al., 1988, 1990). Dalam kajian sebelumnya dalam sel HEp-2, kami telah mengikuti pemprosesan kompleks faktor pertumbuhan epidermis - faktor reseptor faktor pertumbuhan epidermis (EGF-EGFR) dalam perjalanan ke lisosom (Felder et al., 1990Hopkins et al., 1990 Masa Depan et al., 1996). Selepas endositosis, kompleks ini terkumpul dalam badan multivesikular (MVB) yang, ketika pertama kali terbentuk, mengandungi reseptor kitar semula seperti TR (Hopkins et al., 1990 van Deurs et al., 1993), dan kemudian menjalani proses pematangan di mana TR dikeluarkan dan EGF-EGFR terkumpul. MVB kemudian menyatu secara langsung dengan lisosom yang sudah ada dan penurunan EGF bermula (van Deurs et al., 1995 Lebih Masa Depan et al., 1996). M6PR dapat dikesan semasa pematangan MVB dalam sel HEp-2 (van Deurs et al., 1993), tetapi baik MVB yang matang maupun lisosom yang diperkaya dalam M6PR (Masa Depan et al., 1996), menimbulkan persoalan bagaimana M6PR memberikan hidrolase asid ke jalur endosit di sel HEp-2.

Dalam kajian sebelumnya mengenai pematangan MVB dalam sel HEp-2 (van Deurs et al., 1993, 1995 Lebih Masa Depan et al., 1996), lalu lintas M6PR belum diukur secara langsung. Oleh itu, untuk menentukan sama ada sejumlah kecil M6PR yang dapat dikesan dalam MVB yang matang (van Deurs et al., 1993 dan kajian semasa) mewakili jalan pemerdagangan utama reseptor ini, kami secara langsung telah mengukur trafik satu kohort tunggal M6PR yang bebas kation, atau cathepsin D (CD) yang dibawa oleh M6PR, dan telah menunjukkan bahawa sebahagian besar M6PR dan ligannya dipindahkan ke MVB yang memproses kitar semula TR dan EGFR. Kami juga menunjukkan bahawa M6PR cepat mengalir melalui MVB yang matang tanpa terkumpul dalam vakuola ini dan bahawa pada keadaan stabil, M6PR terkonsentrasi di dua laman web (TGN dan dalam vakuola di sitoplasma periferal), tetapi kedua-dua laman web ini tidak berada di jalur pemprosesan yang membawa EGFR dari endosom ke lisosom.


PERBINCANGAN

Dengan menggunakan mikroskopi TIRF dan sensor l -asp berdasarkan FRET untuk mewujudkan ujian fungsi vesikel / transporter tunggal, kami mengesan perolehan tunggal dan berganda dalam beratus-ratus individu GltPh pengangkut secara serentak. Kami tidak mengubah masa separuh kitaran pengangkutan dan kitaran penuh untuk WT GltPh dan mutan keuntungan RSMR dan pengagihan pengedaran kadar pengangkutan yang luas yang biasanya ditutupi dalam pengukuran aktiviti pukal. Di WT GltPh, kami mengenal pasti sekurang-kurangnya tiga populasi yang berbeza secara kinetik dengan kadar yang berbeza-beza mengikut susunan besarnya. Masa perolehan utama untuk WT GltPh berada dalam ratusan saat. Oleh itu, dalam pengukuran pukal, pengambilan substrat yang diperhatikan kebanyakannya disebabkan oleh sebahagian kecil pengangkut cepat, dan kadar yang jelas diukur tidak semestinya sesuai dengan pengangkut yang terdapat dalam populasi. Peningkatan kadar pengangkutan dalam mutan RSMR kebanyakannya disebabkan oleh pergeseran penduduk yang memihak kepada pengangkut cepat.

Pembahagian masa pengangkutan untuk WT GltPh dan mutan RSMR selari dengan pembahagian masa tinggal dalam keadaan menghadap ke luar pengangkut terikat substrat yang diperoleh sebelumnya dalam kajian dinamik konformasi berasaskan smFRET (9, 10), menunjukkan bahawa kadar pengangkutan yang berbeza adalah konsekuensi dari dinamika konformasi yang berbeza dalam protomor transporter individu semasa tingkap pemerhatian. Perbezaan kinetik antara pengangkut cepat, perantaraan, dan lambat nampaknya berterusan selama beberapa kitaran pengangkutan dengan peralihan yang jarang diperhatikan baik dalam ujian pengangkutan dan dalam dinamika (9, 10). Peralihan mod seperti itu, kadang-kadang disebut "memori molekul" atau gangguan statik dari kadar reaksi, sebelumnya telah diamati dalam enzim (1921, saluran ion (2224, reaksi lipatan protein (2932), dan sistem lain di mana kaedah pengesanan molekul tunggal telah dilaksanakan. Biasanya, asas struktur gangguan kadar tidak diketahui. Walau bagaimanapun, dalam satu kes, kadar lipatan protein yang berbeza, yang berlanjutan dalam beberapa peristiwa lipatan / lipatan, disebabkan oleh isomerisasi prolin yang lambat (32). Manakala struktur asas mod fungsi GltPh tidak diketahui, dapat diperhatikan bahawa protein berasal dari hyperthermophilic archaeon dan secara semula jadi berfungsi pada ca. 100 ° C. Nampaknya keadaan struktur entalpi rendah yang "beku" pada suhu persekitaran dan mengalami interkonversi yang sangat perlahan.

Kombinasi pendekatan satu molekul yang menyelidiki peralihan konformasi dan ujian fungsional molekul tunggal memberikan pendekatan yang kuat, dan berpotensi dapat digeneralisasikan, untuk mengakses hubungan antara dinamika dan fungsi pengangkut. Menerapkan pendekatan ini ke sistem yang lebih luas, dan terutama pada pengangkut glutamat manusia yang memainkan peranan penting dalam neurotransmisi glutamatergik, kemungkinan akan membawa pandangan yang tidak diketahui mengenai asas dinamik aktiviti mereka dan mungkin mencadangkan kaedah peraturan farmakologi mereka yang sebelumnya tidak dikenali.


Perbincangan

Dinamika laluan rahsia telah didekati secara historis menggunakan pelbagai teknik. Sesungguhnya, makalah klasik Palade (Jamieson dan Palade, 1967 Palade, 1975) mengenai jalur eksokrin pankreas merangkumi beberapa kursus masa berdasarkan penampilan zarah autoradiografi ke atas struktur selular yang dikenal pasti oleh mikroskop elektron. Kemudian, asid amino berlabel label digunakan sebagai pelacak untuk mengkaji sintesis, pemprosesan, dan pengangkutan protein membran sekretori dan integral (Scheele et al., 1978 Lodish et al., 1983 Fries et al., 1984). Ini memerlukan kaedah penyusunan homogenisasi selular, enzim penanda, kecerunan sukrosa, dan gel poliakrilamida. Ini dan teknik-teknik lain telah menyumbang dan menyumbang kepada pemahaman kami mengenai kinetik laluan rahsia, tetapi terdapat sejumlah masalah yang nampaknya tidak dapat diatasi. Walaupun ER lebih padat daripada cis-Golgi, dan cis-Golgi lebih padat daripada medial, dan seterusnya, dalam prekursor- pesanan produk ke membran plasma, mustahil untuk menyiapkan pecahan murni organel sel tertentu. Walaupun enzim penanda tertumpu pada pecahan tertentu, setelah diasingkan, ia diedarkan dengan cara Gaussian yang lebih kurang di seluruh spektrum petak jalan keluar. Ini menjadikannya sukar untuk diketahui dengan pasti di mana protein berlabel yang diasingkan pada gel terletak di dalam sel. Lebih-lebih lagi, biokimia teknik ini sangat memerlukan tenaga kerja. Oleh itu, sangat jarang sekali terdapat jangka masa lebih dari enam titik data untuk pecahan sel dalam literatur perdagangan protein (Fries et al., 1984 Scheele dan Tartakoff, 1985 Green et al., 1987).

Dalam makalah ini kami menerapkan teknik yang baru dikembangkan untuk mempelajari dinamika perdagangan rahsia: pengimejan selang waktu pendarfluor protein GFP yang ditandai dalam sel hidup. Chimera GFP mudah dinyatakan dalam sel, terang, dan dapat digambarkan berulang kali tanpa pemutihan foto yang signifikan menggunakan teknik mikroskopi pendarfluor konvensional (Cubitt et al., 1995 Sullivan dan Shelby, 1998 Piston et al., 1998). Ia juga dapat ditunjukkan bahawa tag GFP tidak mengubah pengangkutan atau fungsi protein (Lippincott-Schwartz et al., 1998). Ini menjadikannya sesuai untuk mengesan protein melalui jalur intraselular. Kursus masa yang secara berterusan berterusan yang dihasilkan oleh pengimejan selang waktu pendarfluor chimera GFP memungkinkan pengukuran terperinci yang belum pernah terjadi sebelumnya mengenai ciri-ciri kinetik dari jalur sekresi. Ini, pada gilirannya, menyediakan asas untuk menangani untuk pertama kalinya dalam sel hidup tunggal pertanyaan-pertanyaan penting seperti berapa lama protein khas menghabiskan di petak tertentu seperti kompleks Golgi, di mana langkah paling lambat dalam jalan keluar sekretori, dan yang mana langkah-langkah tertakluk kepada kawalan farmakologi atau fisiologi.

Pemodelan Kinetik Pengangkutan Protein Sekretori

Data kinetik untuk pengangkutan VSVG-GFP melalui jalur sekretori diperolehi dari eksperimen pencitraan sel masa dengan sel individu dalam keadaan di mana semua molekul VSVG-GFP pendarfluor dapat dikesan pada bila-bila masa. Perubahan sementara dalam jumlah molekul VSVG-GFP dalam ROI merangkumi wilayah Golgi juxtanuclear dan seluruh sel diukur dan diplot. Kami mendapati bahawa model sederhana yang terdiri daripada serangkaian undang-undang kadar linier yang menghubungkan tiga petak (ER, kompleks Golgi, dan membran plasma) mencukupi untuk memenuhi data. Undang-undang kadar tidak linier yang lebih kompleks (contohnya, Michaelis – Menten) yang melibatkan pemalar kadar berubah (atau pekali kadar) kerana kepekatan VSVG – GFP di petak yang berbeza berubah dari tinggi (awal percubaan) ke rendah (akhir percubaan ) tidak diperlukan. Sebaliknya, setiap masa, VSVG – GFP bergerak di antara petak pada kadar yang sama dengan pemalar kadar (KER, KG, dan KPM) didarabkan dengan jumlah VSVG – GFP di petak penderma.

Keupayaan untuk menyesuaikan data kinetik dengan undang-undang kadar linier menunjukkan bahawa dalam keadaan eksperimen kami VSVG-GFP tidak melepasi batas tepu dan mekanisme pengawalseliaan secara keseluruhan tetap berterusan. Menggabungkan analisis kinetik dengan hubungan yang diketahui antara intensiti pendarfluor dan bilangan molekul, kami memperoleh anggaran fluks puncak VSVG-GFP yang keluar dari setiap organel. Dalam sel yang mengekspresikan 2 × 10 7 molekul VSVG– GFP, fluks keluar puncak ER adalah ∼7.000 molekul VSVG– GFP / s. Puncak puncak dari Golgi adalah 4.000 molekul / detik, dan internalisasi / degradasi dari membran plasma memuncak pada 700 molekul / detik. Kadar pengangkutan ini adalah yang pertama dilaporkan untuk protein tertentu dalam sel hidup tunggal.

Sangat menarik untuk membandingkan fluks puncak VSVG– GFP di tiga petak rahsia dalam model kami untuk data dalam Rajah 2, dengan ukuran yang diperlukan untuk sel dua kali ganda setiap 20 jam. Dengan mengandaikan dua lipid per 1 nm 2, protein hingga ketumpatan lipid 1:50 khas membran plasma (Alberts et al., 1994), dan kawasan membran plasma khas 2.5 × 10 3 μm 2 (Griffiths et al., 1986), kami menyimpulkan bahawa sel harus mensintesis minimum 1.400 protein membran plasma sesaat. Sekiranya perolehan protein dianggap jumlah ini akan menjadi beberapa kali lebih tinggi. Oleh itu, puncak ER ke Golgi fluks 7,000 sesaat atau Golgi ke plasma fluks fluks 4,000 sesaat adalah besar, tetapi tidak mengeruhkan aliran basal sekresi.

Walaupun kami menyesuaikan data pengimejan selang waktu dengan model sederhana yang terdiri daripada tiga petak dan tiga pemalar kadar, masing-masing pemalar kadar ini merangkum banyak proses biokimia yang berlaku pada apa sebenarnya organel heterogen. KER merangkumi proses yang terlibat dalam lipatan dan penyortiran VSVG – GFP di ER, serta proses yang diperlukan untuk penghantaran VSVG – GFP ke kompleks Golgi. KG mewakili semua langkah antara masuk ke kompleks Golgi dan penghantaran ke membran plasma, termasuk pengangkutan intra-Golgi (mis., pengubahsuaian karbohidrat dan pengangkutan antara cisternae), langkah menyusun / mengemas di TGN, dan perdagangan PGC. KPM merangkumi peristiwa pemerdagangan manusia yang berlaku pada membran plasma, termasuk internalisasi dan degradasi. Fakta bahawa undang-undang kadar linier dapat merangkum setiap set proses ini sebagai pemalar kadar tunggal menunjukkan bahawa, dalam setiap set, proses dapat dicirikan secara efektif oleh satu langkah pembatasan kadar tunggal dan bahawa baik identiti atau ciri kuantitatif ini langkah membatasi kadar terganggu oleh perdagangan VSVG – GFP.

Model Pemerdagangan Manusia Yang Gagal

Pemodelan kinetik adalah alat untuk ujian hipotesis kuantitatif. Pada bahagian sebelumnya, kami telah menerangkan model termudah yang sesuai dengan semua data eksperimen kami. Di sini, kami secara ringkas menyenaraikan beberapa hipotesis yang diuji dan didapati menginginkan. Model alternatif pertama tidak termasuk internalisasi dan penurunan VSVG– GFP dari membran plasma. Kami menguji idea ini dengan menghapuskan KPM dan memasang semula data eksperimen. Dalam semua kes, tetapi terutama dalam eksperimen 10-jam, model ini gagal menjelaskan kemerosotan akhir keseluruhan pendarfluor sel. Kami juga menguji kemungkinan penurunan secara perlahan dalam jumlah pendarfluor sel selama 10 jam disebabkan oleh pemutihan cahaya atau penurunan VSVG-GFP dari beberapa petak selular. Hipotesis ini diuji secara kuantitatif dengan membenarkan kehilangan pendarfluor dari setiap petak selular pada satu kadar. Model ini gagal menjelaskan sebahagian besar set data. Lebih-lebih lagi, kami mempunyai demonstrasi eksperimen langsung bahawa pendarfluor selular total tidak berkurang dengan masa semasa pengimejan di salah satu sel yang dirawat dengan BFA untuk mengelakkan eksport VSVG-GFP keluar dari ER atau dalam sel tetap. Model yang melibatkan petak kitar semula Golgi yang perlahan dan bukannya jalur degradasi, atau model yang meletakkan langkah pembatasan kadar untuk internalisasi / degradasi pada endosom akhir (dilokalisasikan dalam ROI Golgi) dan bukannya pada membran plasma, juga tidak dapat menjelaskan cerun terminal dari Golgi dan pendarfluor sel total.

Sebilangan jalan perdagangan lain diuji, dan didapati tidak dapat diselesaikan. Ini bermaksud data tersebut sesuai dengan data yang tersedia, tetapi data tersebut mengandungi informasi yang tidak mencukupi untuk menganggarkan pemalar kadar yang sesuai. Sebagai contoh, kami tidak dapat menyelesaikan petak menengah pasca-Golgi kecuali dalam eksperimen (Gambar 7) yang dirancang khusus untuk analisis PGC dan peristiwa pelakuran. Kami juga tidak dapat menyelesaikan kemungkinan pemerdagangan VRVG-GFP secara retrograd dari percubaan Golgi ke ER di mana ER dapat diselesaikan dari membran plasma kemungkinan penting untuk mengukur sebarang perdagangan VSVG-GFP yang retrograde.

Sebagai kesimpulan, kami telah merumuskan dan menguji banyak model kinetik perdagangan VSVG yang wajar secara fisiologi. Model yang ditunjukkan dalam Gambar 2,A mewakili model termudah yang secara kuantitatif sesuai dengan data eksperimen kami mengenai perdagangan VSVG – GFP dalam sel COS. Dengan pendekatan pengimejan tambahan, kami menjangkakan bahawa model ini mungkin dapat diperhalusi untuk mencirikan jalur tertentu dengan lebih terperinci. Sebagai contoh, dalam Gambar 7 kami menunjukkan bagaimana pemotretan cahaya yang digabungkan dengan pencitraan resolusi tinggi dapat digunakan untuk menyoroti perantara pengangkutan yang terlibat dalam Golgi ke perdagangan membran plasma. Dengan memodelkan data secara kinetik, kami dapat menghitung pecahan total Golgi ke pengangkutan permukaan sel VSVG– GFP yang terjadi oleh PGC, dan untuk menganggar jangka hayat PGC dalam sel.

Nilai Pemalar untuk Perdagangan VSVG – GFP

Pemalar kadar mewakili ciri asas kinetik untuk sebarang proses kerana mereka menggambarkan pecahan bahan yang bergerak melalui proses per unit masa. Untuk pengangkutan ER ke Golgi, pemalar kadar rata-rata untuk VSVG-GFP adalah 2.8% per min, untuk pengangkutan Golgi ke membran plasma adalah 3.0% per minit, dan untuk pengangkutan dari membran plasma ke laman degradatif ia adalah 0.25% per minit . Pemalar kadar mengukur bilangan molekul kargo yang bergerak setiap masa dinormalisasi dengan bilangan molekul yang tinggal untuk dipindahkan. Inilah sebabnya mengapa perubahan dalam pemalar kadar adalah perubahan informatif yang berlaku hanya apabila ketidaklarisan seperti ketepuan dan peraturan fisiologi tercermin dalam data. Dalam Jadual I, misalnya, kami melaporkan penurunan yang signifikan dalam pemalar kadar keluar Golgi yang disebabkan oleh rawatan dengan cyto B. Dalam model kami, perubahan ini tidak mungkin disebabkan oleh penurunan penghantaran VSVG-GFP dari ER, kerana perubahan tersebut akan terjadi tiada kesan pada pemalar kadar keluar Golgi. Sebaliknya, penurunan dalam KG mesti disebabkan oleh perubahan peraturan dalam fungsi Golgi atau mekanisme eksport.

Ketepatan anggaran pemalar kadar kami untuk perdagangan VSVG– GFP belum pernah terjadi sebelumnya. Pekali variasi berkisar antara 2.1 hingga 5.0% bergantung pada pemalar kadar tertentu. Sebaliknya, kinetik denyut nadi-asam amino radiolabel digabungkan dengan pecahan sel dan imunoprecipitasi (yang mewakili keadaan terkini dalam kinetik perdagangan rahsia) biasanya menghasilkan ketepatan dalam julat 30-50% dan dengan demikian susunan magnitud kurang tepat (Fries et al., 1984 Scheel dan Tartakoff, 1985 Green et al., 1987). Ketepatan kaedah pengimejan GFP ini timbul dari dua sumber utama. Pertama, kami mengumpulkan ratusan titik data dari sel yang sama, dan bukannya enam titik data rata-rata lebih dari ribuan sel yang berbeza seperti biasa dalam analisis kinetik biokimia.Kedua, "pecahan" Golgi kami (iaitu, lokasi spasial dalam satu sel) sangat jelas, berbeza dengan pengasingan biokimia pecahan Golgi dari kecerunan di mana pencemaran dengan pecahan organel lain tidak dapat dihindari.

Perbezaan pemalar kadar pada tahap ekspresi rendah dan tinggi VSVG – GFP yang kami perhatikan ketika sel diinkubasi pada jangka pendek atau panjang pada 40 ° C adalah signifikan. Penjelasan yang mungkin untuk ini adalah bahawa tahap ekspresi yang berbeza menyebabkan perubahan fizikal dalam ukuran atau morfologi petak yang mengakibatkan kadar pengangkutan yang berbeza. Sebagai contoh, jika nisbah luas permukaan ER ke laman keluar ER meningkat dengan masa inkubasi yang lebih lama pada 40 ° C, VSVG-GFP boleh mengambil masa lebih lama untuk mencari tempat keluar ER apabila beralih ke suhu permisif sehingga menghasilkan nilai yang lebih rendah KER. Ini berbeza dengan kemungkinan sel-sel yang lebih tinggi mendekati tepu untuk beberapa komponen pengangkutan. Sekiranya itu benar maka akan ada beberapa titik dalam eksperimen ekspresi tinggi apabila kelimpahan VSVG-GFP dalam membran ER dan Golgi jatuh ke tahap eksperimen ekspresi rendah. Pada tahap ini, kadar pemalar yang mencirikan proses pengangkutan dalam sel yang lebih tinggi ekspresinya harus berubah menjadi sel ekspresi yang lebih rendah. Kami tidak memerhatikan perkara ini. Pemalar kadar berbeza, KER, KG, dan KPM dikenal pasti dalam sel yang bersuara tinggi dan rendah dan tidak berubah kerana kepekatan VSVG – GFP berubah dari tinggi (awal percubaan) ke rendah (akhir percubaan). Oleh kerana proses pengangkutan linier sepanjang eksperimen, tidak ada langkah dalam pengangkutan VSVG-GFP yang pernah tepu pada sel ekspresi tinggi dan rendah.

Mengenai Jenis Langkah Mengehadkan untuk Perdagangan VSVG – GFP

Fakta bahawa undang-undang kadar linier dapat dengan tepat menggambarkan proses yang mendasari setiap pemalar kadar kita agak mengejutkan memandangkan luas permukaan membran yang besar kemungkinan akan lalu lintas dengan VSVG-GFP melalui jalur sekretori. Sekiranya kita menganggap bahawa protein transmembran seperti VSVG-GFP dikelilingi oleh cangkang 50 lipid (Edidin, 1997) dan bahawa dua lipid menempati 1 nm 2, maka untuk sel yang dianalisis dalam Rajah 2, dengan 2 × 10 7 molekul VSVG – GFP, ∼500 μm 2 lipid diperlukan untuk mengangkut VSVG – GFP ke membran plasma, dan jumlah kawasan yang serupa ditambahkan ke membran plasma. Bahawa kuantiti membran ini signifikan berbanding dengan luas permukaan membran plasma dalam sel-sel ini disarankan oleh penemuan kami bahawa antara 60-100 minit setelah peralihan ke suhu permisif, bertepatan dengan kedatangan VSVG– GFP ke permukaan, membran plasma mula mengacak dan mengembang ukurannya (lihat Gambar 1 dan filem Quicktime). Kawasan ER adalah berkali-kali luas membran plasma (DePierre et al., 1988), jadi penyataan berlebihan VSVG– GFP mungkin bukan gangguan yang agak besar bagi ER. Luas permukaan kompleks Golgi, di sisi lain, dianggarkan kurang daripada membran plasma (Griffiths et al., 1986), jadi laluan VSVG-GFP dan lipid yang menyertainya melalui Golgi cenderung untuk memperbesar ukuran organel ini.

Dengan mengandaikan jumlah membran yang dihantar ke Golgi setelah pelepasan VSVG-GFP adalah pecahan penting dari yang biasanya ada, garis linier yang kami dapati dalam kinetik VSVG-GFP memberikan petunjuk penting mengenai sifat langkah pembatasan kadar untuk eksport Golgi. Sekiranya langkah pembatasan kadar untuk eksport Golgi melibatkan reaksi binari sederhana antara VSVG-GFP dan beberapa penyusun Golgi (mis., Enzim Golgi atau komponen pengawalseliaan), kami akan menjangkakan KG berbeza secara berlawanan dengan luas permukaan membran Golgi. Ini kerana kepekatan efektif mesin pemprosesan / pengawalseliaan akan dicairkan secara sementara oleh membran yang berkaitan dengan VSVG-GFP. Oleh kerana pengangkutan VSVG – GFP tidak menunjukkan kesan pencairan nonlinier, jalur rembesan nampaknya mempunyai mekanisme yang berkembang yang melindungi proses pemprosesan / pengangkutan protein dari liku-liku lalu lintas membran yang berlebihan.

Salah satu cara untuk mendapatkan kadar yang tidak akan berubah ketika enzim pemprosesan atau komponen pengangkutan dicairkan adalah melalui pemisahan fasa (Siggia, 1979). Fenomena ini dapat terjadi secara seragam di dalam kompartemen, dengan waktunya untuk membuat "fasa-dipisahkan" domain fungsi dari ukuran domain dan bukan ukuran petak. Pemisahan fasa cenderung menjadi milik sistem protein-lipid bersama (mis., Protein dengan panjang / komposisi transmembran tertentu lebih suka lipid dari kelas tertentu [Mouritsen dan Bloom, 1993 Bretscher dan Munro, 1996]). Ia mungkin berlaku ketika bahan diperkenalkan ke Golgi, dan komponen ER dikitar semula kembali ke dalam Golgi ketika, sebagai hasil pemprosesan karbohidrat, spesies tertentu yang tidak dapat dicampur tidak lagi berada atau di tingkat TGN di mana protein disusun untuk dieksport. Idea terkini mengenai domain mikro dan "rakit" dalam kompleks Golgi sesuai dengan idea pemisahan fasa (Harder et al., 1997 Edidin, 1997). Kerana mewakili kategori fenomena yang tidak bertindak balas terhadap pencairan, pemisahan fasa akan memungkinkan proses pengangkutan Golgi untuk menampung bahan ER yang masuk dengan cekap, apa pun ukurannya.

Eksport VSVG-GFP yang dimediasi oleh tubul dari Kompleks Golgi

Visualisasi eksport VSVG-GFP dari kompleks Golgi dengan pengimejan resolusi tinggi di wilayah Golgi 50 minit setelah peralihan ke suhu yang mengizinkan menunjukkan proses tubulus panjang yang mengandungi VSVG-GFP yang berhenti dan terlepas dari kompleks Golgi. Struktur seperti itu bukan artifak ekspresi VSVG-GFP kerana ia diperhatikan pada tahap ekspresi tinggi dan rendah VSVG– GFP dalam pelbagai jenis sel, dan juga dilihat pada sel yang mengekspresikan chimera GFP lain (termasuk kromogranin manusia B dan VSVG larut, data tidak ditunjukkan). Sebaliknya, proses tubul tampaknya berfungsi sebagai alat untuk eksport protein dari kompleks Golgi. Tubgi Golgi sebelumnya telah terlibat dalam eksport protein dari kompleks Golgi. Kajian pencitraan selang masa sel hidup yang berlabel NBD-ceramide (yang lebih disisipkan ke membran TGN, Lipsky dan Pagano, 1985) mendedahkan banyak proses tubulus yang meluas dari kompleks Golgi (Cooper et al., 1990). Selain itu, kajian mikroskopi elektron menunjukkan bahawa tubulus di trans- muka Golgi banyak dan nampaknya "terkelupas" dari Golgi cisternae yang tersusun rapat (Rambourg et al., 1979 Roth et al., 1985 Griffiths and Simons, 1986 Ladinsky et al., 1994). Sesungguhnya, Ladinsky et al. (1994) mendapati bahawa kebanyakan profil vesikular yang bersebelahan dengan TGN yang dilihat pada bahagian nipis tunggal, sebenarnya, tubulus disambungkan ke TGN ketika dibina semula tiga dimensi. Pemerhatian ini, digabungkan dengan data pencitraan selang masa VSVG– GFP yang dilaporkan di sini, menunjukkan bahawa pertumbuhan dan detasmen tubulus Golgi adalah mekanisme asas untuk eksport protein membran keluar dari kompleks Golgi.

Memandangkan peranan tubulus dalam eksport Golgi, apa yang dapat dikatakan mengenai pembentukan dan pengasingan dari membran Golgi? Penemuan kami bahawa nocodazole tidak mempengaruhi eksport VSVG-GFP dari kompleks Golgi secara signifikan menunjukkan bahawa tubulus yang terlibat dalam eksport Golgi tidak memerlukan mikrotubulus untuk membentuk atau melepaskan diri dari kompleks Golgi. Sebaliknya, mikrotubulus nampaknya hanya berperanan dalam peluasan periferal dan translokasi struktur ini. Kelewatan jalan keluar VSVG-GFP dari Golgi dalam sel yang dirawat cyto B, sebaliknya, menyiratkan unsur sitoskeletal berasaskan aktin memudahkan eksport protein dari kompleks Golgi (Fath dan Burgess, 1993 Musch et al., 1997). Menariknya, tubulus turunan Golgi terbentuk dalam sel yang dirawat cyto B, tetapi ia lebih lama daripada sel yang tidak dirawat (data tidak ditunjukkan), menunjukkan komponen sitoskeletal berasaskan aktin boleh terlibat dalam pemisahan perantara pengangkutan ini (Musch et al. , 1997). Penemuan bahawa AlF menghapuskan semua eksport VSVG-GFP dari kompleks Golgi menunjukkan bahawa komponen sensitif AlF mendasari eksport protein Golgi, dan sesuai dengan karya Melancon et al. (1987) dan Yoshimori et al. (1996). Sama ada AlF menyekat eksport protein dari Golgi dengan menghalang penyortiran VSVG-GFP ke tempat keluar Golgi (contohnya, dengan vesikulasi membran Golgi yang disebabkan oleh pengikatan protein lapisan periferal secara besar-besaran) atau oleh beberapa mekanisme lain masih belum dapat ditentukan.

Fakta bahawa protein lapisan Golgi β-COP dan AP1 tidak melokalisasikan tubulus yang mengandungi VSVG-GFP menunjukkan bahawa protein ini tidak terlibat secara langsung dalam pembentukan tubulus. Sama ada protein pelapis lain akan dikenal pasti yang melokalisasikan tubulus dan mengatur fungsinya perlu ditangani dalam pekerjaan masa depan. Walau bagaimanapun, mekanisme alternatif untuk pertumbuhan struktur ini kepada struktur yang hanya berdasarkan pada pengambilan dan pembalakan kot harus dipertimbangkan. Idea terkini mengenai penyortiran berdasarkan lipid di TGN memberikan satu model yang mungkin untuk bagaimana VSVG-GFP dapat menyusun proses tubulus (Harder dan Simons, 1997).

Soalan penting ialah sama ada penyortiran VSVG– GFP berlaku sebelum atau semasa pembentukan tubulus dan hubungan apa yang wujud antara penyortiran protein dan tubulasi di TGN (Geuze dan Morre, 1991 Griffiths and Simons, 1992 Ladinsky et al., 1994). Kehadiran dynamin (a GTPase) pada membran Golgi menimbulkan kemungkinan bahawa protein ini mungkin mempunyai peranan dalam pembentukan dan / atau pelepasan tubulus Golgi (Jones et al., 1998). Kajian in vitro telah menunjukkan bahawa dynamin dapat mengubah liposom menjadi tubulus yang terputus setelah penambahan GTP (Sweitzer dan Hinshaw, 1998 Takei et al., 1998). Oleh kerana pembentukan tubulus dan detasmen dari membran Golgi adalah proses dinamik yang berlaku pada skala waktu yang cepat, kajian pencitraan selang masa terhadap kargo yang berbeza dan protein yang dilampirkan secara periferal yang berkaitan dengan tubulus Golgi yang dicitrakan secara serentak dalam sel menggunakan chimera GFP yang membangkitkan / mengeluarkan pada berbeza panjang gelombang cahaya (Heim dan Tsien, 1996 Rizzuto et al., 1996 Ellenberg et al., 1998 Zimmermann et al., 1998) harus menjadi alat penting untuk menangani persoalan ini.

Pencirian PGC

Setelah melepaskan diri dari kompleks Golgi, elemen tubul yang mengandung VSVG-GFP biasanya berpindah ke pinggir sel dan mengalami perubahan bentuk yang dramatik (memanjang keluar sebagai tubulus dan kemudian menarik kembali ke badan sfera) semasa pengangkutan. Pergerakan PGC ini sangat kemas dan berlaku pada kelajuan maksimum 2.7 μm / s. Fakta bahawa nocodazole, tetapi tidak cyto B, menyekat pergerakan PGC menunjukkan bahawa struktur ini bergerak di sepanjang trek mikrotubulus daripada sistem sitoskeletal berasaskan aktin. Pemerhatian ini serupa dengan yang diperoleh dari kajian lain yang telah memeriksa pengangkutan eksositik kargo sekretori (Wacker et al., 1997 Nakata et al., 1998 Toomre et al., 1998). Dalam kajian tersebut dan juga kajian kami, pergerakan bersih struktur pasca-Golgi keluar dari wilayah Golgi ke pinggiran sel. Ini menunjukkan bahawa protein motor mikrotubulus tambahan akhir, kinesin, terlibat. Pergerakan ini berbeza dengan gerakan serentak tolak arah yang seragam yang diperhatikan untuk struktur pra-Golgi yang membawa VSVG-GFP (Presley et al., 1997 Scales et al., 1997) yang telah dicadangkan untuk dimediasi oleh sitoplasma dynein (Presley et al. , 1997 Burkhardt, 1998). Wawasan mengenai identiti protein motor terarah akhir dan minus ini (dan komponennya yang berkaitan) dan memahami bagaimana mereka menyelaraskan lalu lintas membran masuk dan keluar dari kompleks Golgi adalah cabaran penting untuk pekerjaan masa depan.

Walaupun pergerakan PGC dihambat oleh depolimerisasi mikrotubulus, kami mendapati bahawa VSVG-GFP masih dihantar ke membran plasma dalam keadaan ini. Satu penjelasan untuk penemuan ini adalah bahawa jenis sel yang digunakan dalam eksperimen ini (iaitu, COS) sangat rata, dengan jarak hanya 1-2 mm antara kompleks Golgi dan / atau PGC ke membran plasma yang terlalu banyak. Penyampaian VSVG-GFP ke membran plasma selepas gangguan mikrotubulus oleh itu kemungkinan berlaku oleh penyebaran PGC secara rawak dan peleburannya dengan tapak membran plasma yang berdekatan.

Teknik pengimejan kuantitatif kami menunjukkan bahawa PGC yang diperkaya dalam VSVG-GFP adalah besar (menempati luas rata-rata 1.3 μm 2) dan bahawa mereka membawa sejumlah besar kargo VSVG-GFP. Semasa puncak aliran VSVG– GFP keluar dari kompleks Golgi, misalnya, PGC individu membawa rata-rata 10,000 molekul VSVG – GFP. Begitu juga struktur eksositik yang besar telah diperhatikan oleh Nakata et al. (1998) dalam kajian pencitraan mereka menggunakan protein sekretori bertanda GFP.

Kami mendapati bahawa PGC adalah kenderaan utama untuk penghantaran VSVG – GFP ke permukaan sel. Dalam eksperimen di mana perjalanan waktu untuk penampilan VSVG-GFP ke kawasan pemutihan cahaya di luar kompleks Golgi diukur, lebih daripada 60% pendarfluor sel yang muncul kembali melakukannya melalui PGC. Daripada penyebaran vesikel kecil ke dalam kotak pemutihan cahaya, sebahagian besar baki pendarfluor yang pulih kemungkinan berasal dari PGC yang menyatu dengan membran plasma di kawasan di luar kotak pemutih cahaya, yang membolehkan VSVG-GFP bergerak dengan penyebaran lateral di sepanjang permukaan sel ke dalam kotak pemutihan cahaya. Selaras dengan kemungkinan ini, pemulihan sisa VSVG – GFP yang tersisa ke kawasan pemutihan foto lebih daripada 15 kali lebih cepat daripada pergerakan PGC (dan mungkin vesikel) di dalam sitoplasma. Dari eksperimen ini, kami juga dapat menentukan bahawa PGC mempunyai jangka hayat purata ∼3.8 min dalam sel COS. Lebih-lebih lagi, kita dapat menunjukkan bahawa PGC yang membawa VSVG-GFP menyatu secara langsung dengan membran plasma tanpa memotong jalur membran lain di dalam sel.

Keupayaan untuk memvisualisasikan dan memodelkan perdagangan protein dalam sel tunggal menggunakan teknologi GFP memberikan pendekatan baru yang kuat untuk menangani banyak persoalan yang berkaitan dengan peraturan dan fungsi jalan keluar sekretori. Adakah molekul kargo yang berlainan melintasi kompleks Golgi pada kadar yang sama, seperti yang diramalkan oleh model kemajuan sisteri? Adakah terdapat kelewatan pengangkutan antara subkompartemen Golgi? Langkah-langkah perdagangan apa yang dipengaruhi oleh gangguan dalam mesin pemerdagangan manusia dan apakah mereka tertakluk kepada kawalan farmakologi? Kelebihan dua kali ganda dari kuantitatif dan eksperimen in vivo menggunakan konstruk GFP semestinya membenarkan analisis persoalan pusat mengenai fungsi membran dan pemerdagangan manusia. Sebagai contoh, pemutihan kilat dari chFP kamera dapat digabungkan dengan analisis kinetik untuk menentukan subpopulasi membran baru atau menonjolkan perantaraan. Penggunaan varian GFP dua warna dalam kajian pelabelan berganda, kini dapat dilaksanakan secara teknikal (Rizzuto et al., 1996 Ellenberg et al., 1998 Zimmermann et al., 1998), menambah lebih banyak keupayaan. Pendekatan seperti ini memperluas pemahaman kita tentang dinamika laluan sekretori, dan berjanji untuk memberi penerangan baru mengenai bagaimana mesin molekul berfungsi secara sistematik dalam membran sekretori sel hidup.


Perbincangan

Lima subtipe transporter glutamat telah diklon hingga kini. Sifat fungsional subtipe transporter 1-3, yang telah banyak dikaji, sangat serupa antara satu sama lain, termasuk kinetik pengangkutan glutamat mereka. Oleh itu, timbul persoalan: Mengapa kita memerlukan begitu banyak subtipe yang berbeza?

Di sini, kami melaporkan untuk pertama kalinya bahawa beberapa ciri fungsional subtipe EAAT4 secara dramatik berbeza dengan subtipe 1-3, walaupun pengangkut mempunyai mekanisme pengangkutan yang sama. Penemuan baru pertama dari kajian ini adalah bahawa subtipe EAAT4 transporter glutamat beroperasi 5-10 kali lebih perlahan daripada subtipe transporter EAATs 1-3 (parameter kinetik dirangkum dalam Jadual II). Kedua, pengangkutan EAAT4 mempunyai kebergantungan yang berbeza secara signifikan pada potensi transmembran daripada subtipe 2 dan 3. Contohnya, EAAT4 menjadi terhambat pada voltan yang sangat negatif dan pertalian EAAT4 yang nyata untuk glutamat bergantung pada voltan, sedangkan EAATs 2 dan 3 bebas voltan (Wadiche et al., 1995b Grewer et al., 2000). Ketiga, hubungan EAAT4 untuk glutamat dan ion Na + yang diangkut secara signifikan lebih tinggi daripada EAAC1 (Grewer et al., 2000 Watzke et al., 2001).

Mekanisme Pengangkutan Glutamat oleh EAAT4

Mekanisme umum pengangkutan substrat oleh EAAT4 sangat serupa dengan subtipe transporter yang dicirikan sebelumnya. Bagi EAATs 2 dan 3, pengangkutan glutamat berdasarkan mekanisme berurutan di mana glutamat dan Na + ditranslokasi pada langkah reaksi yang sama, sedangkan K + diangkut secara kontra dalam reaksi penempatan semula transporter bebas glutamat. Oleh itu, translokasi glutamat masih boleh berlaku dengan ketiadaan K + intraselular, sedangkan peralihan keadaan tetap dihambat dalam keadaan ini. Kami menganggap bahawa arus anion keadaan mapan terutamanya dibatasi oleh peralihan T + ke T yang bergantung pada K + dalam Skema 1. Kesan Na + dan K + yang berbeza pada pengangkutan glutamat oleh EAAT4 diserlahkan oleh kesannya yang berbeza pada EAAT4 prestij-keadaan semasa. Dalam ketiadaan K + intraselular secara maya, arus anion sementara yang disebabkan oleh glutamat masih ada (dikaitkan dengan N-translotasi glutamat2TG ke N2Peralihan T'G dalam Skema 1), tetapi komponen arus anion keadaan stabil dihapuskan (Rajah 6 C). Sebaliknya, kepekatan Na + ekstraselular yang rendah mengakibatkan penghambatan komponen arus anion yang disebabkan oleh glutamat sementara, tetapi arus keadaan tetap masih diperhatikan (Gbr. 6 D). Hasil ini menunjukkan bahawa reaksi penempatan semula yang disebabkan oleh K + menjadi pembatasan kadar untuk peralihan keadaan mantap pada intraselular rendah [K +], sedangkan reaksi translokasi yang bergantung pada Na + menjadi pembatasan kadar pada ekstraselular rendah [Na +].

Seperti dalam EAAC1, pengikatan Na + dan glutamat ke EAAT4 adalah berurutan (Watzke et al., 2001). Glutamat berinteraksi dengan EAAT4 hanya setelah ion Na + pertama terikat. Selepas itu, pengikatan glutamat menghasilkan laman pengikat hubungan kedua yang tinggi untuk Na + pada transporter. Bukti utama untuk mekanisme pengikat Na + -glutamate-Na + berurutan ini berasal dari ketergantungan [Na +] yang ditentukan secara eksperimen terhadap arus maksimum yang disebabkan oleh glutamat pada kepekatan glutamat tepu (Sayamaks), yang menurun pada kepekatan natrium rendah, menunjukkan bahawa sekurang-kurangnya satu Na + mesti mengikat pengangkut setelah glutamat terikat. Sebaliknya, jika semua ion Na + yang diangkut akan mengikat EAAT4 sebelum glutamat, diharapkan Sayamaks adalah bebas daripada kepekatan Na + (Watzke et al., 2001).Dalam kes ini, melainkan pengikatan Na + menjadi pengehad kadar untuk pengangkutan keadaan tetap pada suhu yang sangat rendah [Na +], kepekatan glutamat jenuh diharapkan dapat menarik keseimbangan pengikatan Na + ke arah bentuk terikat, sehingga dapat mengatasi kesan penghambatan rendah [ Na +] pada kadar pengangkutan keadaan tetap. Hasil kami juga memberi batasan pada stoikiometri Na +: glutamat cotransport dari EAAT4, yang sejauh ini belum ditentukan secara eksperimen. Stoikiometri gandingan ini sekurang-kurangnya 2 glutamat Na +: 1, tetapi kemungkinan sama dengan stoikiometri 3: 1 EAATs 2 dan 3 (Zerangue dan Kavanaugh, 1996 Levy et al., 1998).

Kadar pengambilan glutamat keadaan mantap agak meningkat di hadapan SCN - pada kedua-dua sisi membran. Kesan ini menunjukkan bahawa SCN - sebagai anion chaotropik mungkin mempunyai peranan modulasi pada pengangkutan glutamat oleh EAAT4. Walaupun pemalar kadar ditentukan dari analisis kinetik keadaan pready untuk cabang translokasi glutamat kitaran sama dengan ketiadaan dan kehadiran SCN - (Gbr. 8 D), dapat dihipotesiskan bahawa anion mempengaruhi kadar laju mengehadkan langkah kitaran pengangkutan di cabang bergantung kalium. Eksperimen tambahan akan diperlukan untuk menguji hipotesis ini. Walau bagaimanapun, hasil ini menunjukkan bahawa penting untuk berhati-hati dalam menafsirkan mekanisme pengangkutan semata-mata berdasarkan data yang diperoleh dari arus anion.

Pergantungan Voltan Pengangkutan Glutamat oleh EAAT4

Menariknya, pengangkutan glutamat oleh EAAT4 mempunyai pergantungan voltan yang unik yang belum pernah diperhatikan sebelumnya. EAAT menunjukkan aktiviti pengangkutan maksimumnya hampir 0 hingga −20 mV dan tidak aktif pada potensi membran yang lebih negatif. Proses inaktivasi ini berlaku dengan pemalar masa dalam julat 15 ms setelah lonjakan potensi membran. Ketidakaktifan paling ketara dalam keadaan pengangkutan ke hadapan dan dilihat pada tahap pertukaran mod yang lebih rendah, menunjukkan bahawa langkah-langkah dalam cabang kitar pengangkutan yang bergantung pada kalium lambat pada voltan yang sangat negatif, sehingga menyebabkan terjebaknya EAAT4 di negeri-negeri yang berkaitan dengan penempatan semula kalium. Keadaan yang berkaitan dengan kitaran separuh yang bergantung pada K + bukan anion. Oleh itu, bukan sahaja pengangkutan, tetapi juga konduktansi anion dihambat pada potensi negatif. Dalam mod pertukaran, keadaan yang berkaitan dengan pengangkutan K + tidak dapat diakses, seperti yang ditunjukkan sebelumnya untuk EAAC1 (Watzke et al., 2001). Oleh itu, penonaktifan arus anion tidak begitu menonjol dalam mod pertukaran. Model kinetik sederhana yang ditunjukkan dalam Skema 1 menerangkan data eksperimen dengan sangat baik, seperti yang ditunjukkan dalam simulasi berangka (Gambar 10, A dan B). Model ini meramalkan bahawa ketidakaktifan pada potensi negatif disebabkan oleh penghambatan pengikatan kalium intraselular, penempatan semula yang disebabkan oleh K +, atau pemisahan K + ekstraselular (disatukan ke peralihan T 'ke T dalam Skema 1). Valence jelas yang berkaitan dengan tindak balas masing-masing dihitung sebagai −1, mempunyai tanda yang berlawanan dibandingkan dengan valensi jelas dari reaksi separa lain yang sejauh ini diperhatikan pada pengangkut glutamat. Oleh itu, reaksi ini diperlahankan dengan potensi transmembran yang semakin negatif, sedangkan reaksi yang berkaitan dengan pengikatan Na + dan translokasi glutamat dipercepat. Tafsiran ini berbeza dengan laporan sebelumnya mengenai subtipe transporter glutamat yang lain. Dalam EAAC1, diusulkan bahawa kadar reaksi relokasi yang disebabkan oleh K + dipercepat pada potensi negatif kerana muatan positif yang bergerak ke luar semasa pengangkutan K + dikompensasi oleh cas negatif dari laman pengikat kation (Grewer et al., 2000 Grewer dan Rauen, 2005). Sesuai dengan model ini, tidak ada pengaktifan arus anion pada potensi negatif (lihat Gambar 3 A dan pemodelan pada Gambar 10 A). Cas positif yang bergerak ke luar semasa pengangkutan K +, oleh itu, tidak dikompensasi oleh cas negatif dalam EAAT4, atau pengikatan K + elektrogenik dari sisi intraselular menjadi pembatas kadar.

Pemerhatian menarik kedua untuk EAAT4 adalah bahawa pertalian jelas untuk glutamat bergantung kepada voltan. Perkaitan bertambah dengan voltan yang semakin negatif (Gamb. 4 E). Tingkah laku ini berbeza dengan EAAC1, yang menunjukkan pertalian tegangan bebas untuk glutamat, dan juga dapat dijelaskan oleh model pengangkutan sederhana yang ditunjukkan dalam Skema 1. Menurut model ini, perangkap glutamat oleh EAAT4 dan penjanaan semula glutamat bebas laman pengikat mempunyai pergantungan voltan yang berlawanan. Oleh itu, voltan negatif menyebabkan perangkap glutamat lebih cekap dan, oleh itu, pertalian yang lebih tinggi. Tingkah laku ini juga dapat diukur mengikut Persamaan. 5A dan 5B, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 10 B. Namun, pergantungan voltan dari model Km sedikit lebih curam daripada yang ditentukan secara eksperimen. Sebabnya mungkin terdapat reaksi separa lain dalam mekanisme pengangkutan yang mempengaruhi pergantungan voltan pengangkutan EAAT4 yang tidak diperhatikan di sini.

Harus diingat bahawa keberanian yang jelas dalam Skema 1 dipilih untuk menghasilkan sejumlah +2 caj yang diangkut dalam satu putaran penuh. Ini memerlukan satu ion H + dan tambahan, ion Na + ketiga diangkut bersama glutamat, ion yang diabaikan untuk kesederhanaan dalam Skema 1. Walaupun kami tidak mempunyai data mengenai sumbangan pergerakan mengikat dan / atau transmembran kedua ion ini kepada electrogenicity transporter, ada kemungkinan bahawa electrogenicity yang disebabkan oleh pergerakan mereka menambah keelektrogenisan beberapa langkah tindak balas yang ditunjukkan dalam Skema 1. Oleh itu, valensi yang disenaraikan dalam Jadual I adalah nilai yang jelas dan tidak intrinsik terhadap langkah reaksi individu yang ditunjukkan dalam Skema 1, yang mengandungi tindak balas pengikatan ion lain yang tidak ditunjukkan.

Perbandingan dengan Kajian Sebelumnya yang Melibatkan EAAT4 yang Diekspresikan Secara Asli di Neuron Cerebellar

Dalam dua laporan sebelumnya, kinetika transporter prasyarat yang dinyatakan secara asli dalam sel Purkinje cerebellar telah dikaji (Otis dan Jahr, 1998 Auger dan Attwell, 2000). Dalam laporan pertama, kinetika konduktansi anion transporter glutamat yang dinyatakan disiasat (Otis dan Jahr, 1998). Kinetik ini berbeza dengan ketara dari EAAT4 rekombinan yang dilaporkan di sini. Pertama, kadar kenaikan dan kerosakan komponen arus sementara jauh lebih besar daripada kadar yang dilaporkan di sini. Sebagai contoh, komponen sementara arus anion yang disebabkan glutamat merosot dalam transporter sel Purkinje dalam & lt50 ms, sedangkan arus sementara EAAT4 rekombinan merosot dalam 100 ms (Gamb. 7 B). Kedua, nisbah arus sementara ke keadaan stabil jauh lebih besar dalam laporan Otis dan Jahr (Otis dan Jahr, 1998) berbanding dengan hasil kami. Ketiga, transporter sel Purkinje mempunyai pertalian glutamat yang jelas dalam julat 3 μM, sedangkan kita menemukan nilai dalam julat submikromolar. Sebaliknya, kinetik transporter yang disiasat dalam (Otis dan Jahr, 1998) nampaknya sangat serupa dengan yang dilaporkan oleh kami sebelumnya untuk EAAC1 yang dinyatakan secara rekombinan (Grewer et al., 2000), yang juga dinyatakan dalam neuron otak kecil Purkinje ( Rothstein et al., 1994 Furuta et al., 1997). Dalam laporan kedua, kinetik arus anion berpagar glutamat, dan juga arus pengangkutan, telah dikaji (Auger dan Attwell, 2000). Walaupun perbandingan langsung hasil yang dilaporkan oleh Auger et al. untuk hasil kami lebih sukar, kerana penulis menggunakan glutamat pada transporter hanya untuk jangka waktu yang pendek (1 ms), nampaknya kedua-dua komponen semasa menunjukkan kinetik lebih cepat daripada kinetik semasa EAAT4 yang dilaporkan di sini. Sekali lagi, kinetik ini lebih mengingatkan EAAC1 yang dinyatakan secara heterologi (Grewer et al., 2000 Watzke et al., 2001). Perlu diingatkan bahawa terdapat dua kemungkinan penjelasan lain untuk kinetik EAAT4 rekombinan yang berbeza dan pengangkut asli. (1) Protein yang dinyatakan secara semula jadi mungkin diubah secara posttranslationally pada neuron berbanding dengan sistem sel HEK293 yang digunakan di sini. (2) Kepekatan glutamat yang digunakan dalam kajian di atas jauh lebih tinggi (2 mM) daripada maksimum ∼100 μM yang digunakan di sini. Walau bagaimanapun, kerana EAAT4 menunjukkan tingkah laku jenuh pada kepekatan & gt50 μM, tidak mungkin penggunaan [glutamat] yang lebih tinggi akan menghasilkan kinetik yang jauh lebih cepat.

Kepentingan Fisiologi

EAAT4 dinyatakan dalam tahap tinggi dalam otak kecil, khususnya dalam sel Purkinje (Furuta et al., 1997). Ekspresi dalam neuron Purkinje diarahkan ke kawasan di dendritic spines, yang sedikit dikeluarkan dari kontak sinaptik rangsangan (Dehnes et al., 1998) di mana glutamat dilepaskan. Oleh itu, kemungkinan glutamat yang dilepaskan secara presinaptik pertama kali bersentuhan dengan pengangkut berkekuatan tinggi, rendah EAAT2, yang dinyatakan dalam sel glia yang mengelilingi sinaps serat pendakian dengan erat (Bergles et al., 1997). Sistem pertalian rendah ini menghilangkan sebahagian besar glutamat yang dilepaskan, tetapi tidak berfungsi dengan berkesan apabila kepekatan glutamat mencapai tahap mikromolar rendah. Kami berspekulasi bahawa molekul glutamat yang melepaskan penyerapan oleh pengangkut glial dan meresap lebih jauh dari kenalan sinaptik dikeluarkan oleh EAAT4 transporter berkekuatan rendah neuron tinggi. Oleh itu, fungsi utama EAAT4 adalah untuk mencegah tumpahan ke sinaps bersebelahan dan menjaga kepekatan glutamat ekstraselular pada tahap submikromolar. Walau bagaimanapun, kerana kinetiknya yang perlahan dan penyetempatannya dikeluarkan dari sinaps, tidak mungkin terlibat secara langsung dalam menghentikan proses transmisi sinaptik, terutamanya kerana keupayaan pengambilan glutamat EAAT4 yang sangat rendah.

Oleh kerana EAAT4 diharapkan dapat beroperasi pada kepekatan mikromolar rendah hingga kepekatan submicromolar glutamat, dapat diduga bahawa transporter tidak dioptimumkan untuk operasi cepat. Pada kepekatan 0.5 μM, EAAT4 hanya mengikat satu molekul glutamat setiap 100 ms. Oleh itu, penangkapan glutamat oleh pengangkut kemungkinan besar adalah langkah yang membatasi kadar dan reaksi pengangkut lain, seperti translokasi glutamat, agak cepat. Sebaliknya, EAAT4 nampaknya dioptimumkan untuk pengikatan glutamat yang ketat. Beberapa faktor menyumbang kepada pengoptimuman ini jika dibandingkan dengan subtipe transporter yang lain: (a) afinasi Na + mengikat laman web yang lebih tinggi menghasilkan pertalian yang lebih jelas untuk glutamat (b) pemisahan glutamat yang lebih perlahan membawa kepada pengikatan yang lebih ketat (c) pergantungan voltan yang unik dari pengangkutan menghasilkan pertalian yang lebih tinggi pada potensi transmembran fisiologi dan, dengan demikian, untuk memerangkap glutamat lebih cekap. Akan menarik untuk menentukan asas molekul untuk pengoptimuman hubungan tinggi EAAT4 ini.

Perangkap glutamat yang lebih cekap oleh EAAT4 pada potensi transmembran fisiologi diharapkan dapat memanjangkan keadaan anion pada subtipe pengangkut glutamat ini. Tindakan hiperpolarisasi EAAT4 dapat menangkal tindakan depolarisasi pengangkut glutamat "pertalian rendah dan kapasiti tinggi", seperti EAAT3. EAAT3 dan EAAT4 dikekspresikan dalam dendrit sel Purkinje (Conti et al., 1998 Dehnes et al., 1998 Kugler dan Schmitt, 1999), menunjukkan kemungkinan adanya interaksi kerjasama antara kedua subtipe transporter.


HDL: Pengangkutan kolesterol terbalik

Fungsi utama lipoprotein berkepadatan tinggi (HDL) adalah untuk mengangkut kolesterol berlebihan yang diperoleh dari tisu periferal ke hati. HDL juga mempunyai peranan lain yang penting dalam pengangkutan lipid seperti menukar protein dan lipid dengan chylomicrons dan VLDL. Zarah-zarah HDL dapat dibuat dengan beberapa mekanisme, namun HDL yang baru lahir terutama dirembeskan dari hati dan usus sebagai zarah-zarah yang relatif kecil yang cangkang, seperti lipoprotein lain, mengandungi fosfolipid, kolesterol bebas, dan pelbagai apoprotein, khususnya apoAI, apoAII , apoCI, dan apoCII. Tahap triacylglycerols atau ester kolesterol yang sangat rendah dijumpai di inti berongga versi HDL awal atau baru ini.

Rajah 6.10: Interaksi chylomicrons dan VLDL dengan HDL dalam edaran.

HDL juga dapat dihasilkan melalui pemula apoA dari chylomicrons dan partikel VLDL atau dari apoAI bebas, yang mungkin diturunkan dari lipoprotein beredar lain. Dalam kes ini, apoAI memperoleh kolesterol dan fosfolipid dari lipoprotein lain dan membran sel, membentuk zarah HDL yang baru lahir dalam peredaran (Gambar 6.10).


Keputusan

Pertumbuhan dan pencirian histologi MCL

Lapisan multisel dikultur dari sel adenokarsinoma kolon DLD1 pada membran PTFE yang dilapisi kolagen (Gambar 1), yang dilayang dalam termos pemintal untuk memberikan keadaan yang optimum untuk pertumbuhan. MCL digunakan pada hari ketujuh budaya dan menunjukkan kedalaman tisu 131 ± 10 μm. Ujian berasaskan pimonidazole digunakan untuk mengesan hipoksia pada MCL dan menunjukkan morfologi tisu (Rajah 1D). Pencirian morfologi penuh model tisu ini telah dijelaskan sebelumnya (Modok et al, 2006). MCL menunjukkan pimonidazole pewarnaan ke permukaan atas tisu, yang menunjukkan hipoksia. Hipoksia setempat ini dapat dijelaskan oleh permintaan oksigen yang tinggi, yang disebabkan oleh populasi sel avaskular yang padat, serupa dengan spheroid tumor. Ini menunjukkan bahawa model MCL adalah representasi yang baik dari seni bina tumor pepejal dan persekitaran mikro yang berkaitan (Modok et al, 2006).

Kefasihan dan kadar pengambilan selular sebatian [14 C] -Pt (II) dan [14 C] -Pt (IV) dalam MCL

Pengangkutan sebatian melalui membran PTFE dengan atau tanpa MCL diukur dengan memuatkan ubat-ubatan yang berlabel label ke DC dan mengukur radioaktiviti yang muncul di RC dari masa ke masa (Gambar 1A). Pada mulanya, 150 dan 1000 μL volume media kultur masing-masing dimuat ke DC dan RC, untuk mengekalkan tahap cecair yang setara dan oleh itu mengelakkan pengangkutan konvektif yang didorong oleh tekanan hidrostatik. Pengikatan sebatian yang tidak spesifik ke permukaan plastik di DC dan RC ditentukan untuk meningkatkan ketepatan analisis kuantitatif berikutnya (Jadual 1). Sebagai contoh, pecahan yang terikat pada DC mengurangkan kecerunan kepekatan berkesan, sedangkan pecahan yang terikat pada RC secara salah mengurangkan kadar fluks. Pecahan yang terikat pada DC dan RC digunakan untuk membetulkan kepekatan ubat permulaan dan kepekatan ubat yang diangkut, masing-masing. Kepekatan kumulatif [14 C] -Pt (II) dan [14 C] -Pt (IV) dinyatakan sebagai peratusan kepekatan ubat awal di DC.

Rajah 2 menunjukkan jumlah kumulatif kompleks Pt yang muncul di DC radas MCL. Data disediakan untuk fluks semasa atau tidak adanya tisu MCL yang dilapisi pada membran PTFE. Seperti yang dijangkakan, kadar dan tahap fluks adalah lebih besar untuk kedua-dua ubat sekiranya tiada MCL. Data dalam Rajah 2 menunjukkan dengan jelas bahawa tidak ada perbezaan antara [14 C] -Pt (IV) dan [14 C] -Pt (II) berkenaan dengan penampilan kumulatif mereka di DC. Pemodelan matematik tanpa parameter pengambilan sel tidak sesuai dengan data yang diperoleh dengan adanya MCL, tetapi merupakan refleksi tepat untuk melintasi membran PTFE sahaja. Model matematik yang terdiri daripada pekali pengambilan digunakan untuk mengukur aliran sebatian melalui model tumor pepejal dan data diringkaskan dalam Jadual 2. Pekali pemindahan jisim (kdan keliangan relatif (ψ) nilai kedua sebatian platinum melalui MCL tidak dapat dibezakan. Pekali penyebaran dipastikan untuk ubat Pt (IV) dan Pt (II) melalui model MCL yang menggunakan parameter pekali pemindahan massa (k), Ketebalan MCL (xM), penyebaran dalam medium (D1dan kepekatan ubat awal (CD). Pekali penyebaran yang dikira (DMdan pengambilan selular (g) kadar tidak berbeza untuk dua sebatian platinum (Jadual 2), yang mencerminkan parameter fluks yang serupa untuk dua kelas kompleks platinum dalam tisu padat.

Flux kinetics [14 C] -Pt (II) dan [14 C] -Pt (IV) melalui MCL. Biasanya, kepekatan 6 μ M [14 C] -Pt (II) (•) dan 18 μ M [14 C] -Pt (IV) (○) diberikan kepada DC. Penampilan sebatian radiolabel di RC diukur seperti yang dijelaskan dalam Bahan dan Kaedah. Kepekatan kumulatif dalam CR (CR) dibahagi dengan kepekatan awal di DC (CD) dan diplotkan sebagai min ± s.d. peratusan tiga eksperimen bebas. Lengkung dipasang menggunakan model matematik dengan (+) atau tanpa (-) istilah untuk pengambilan sel seperti yang dijelaskan dalam Bahan dan Kaedah. Flux diukur melalui (A) membran PFTE sahaja dan (B) MCL tumbuh pada membran PFTE.

Pengumpulan sel [14 C] -Pt dalam analisis MCL SRIXE

Pengumpulan sebatian Pt dalam MCL ditentukan dengan mengukur radioaktiviti yang dipertahankan dalam membran PTFE ± MCL setelah ujian pengangkutan. Seperti yang ditunjukkan dalam Jadual 1, radioaktiviti yang berkaitan dengan membran lebih tinggi dengan adanya MCL, walaupun tidak ada perbezaan yang signifikan antara [14 C] -Pt (II) dibandingkan dengan [14 C] -Pt (IV). Data dari pemodelan matematik di atas menunjukkan tahap pengambilan ubat Pt dalam jaringan MCL. Analisis gambar menggunakan SRIXE digunakan untuk mengesahkan cadangan ini dan teknik ini memungkinkan analisis elemen yang luas dari tisu MCL. Data menunjukkan bahawa tisu yang telah terkena ubat [14 C] -Pt (IV) dikaitkan dengan isyarat Pt gabungan (Gambar 3). Ini mengesahkan data pemodelan eksperimen dan matematik dan menunjukkan bahawa aliran melalui tisu pepejal dikaitkan dengan tahap pengambilan ubat Pt yang tidak dapat diabaikan ke dalam sel. Kuantasi isyarat Pt di seluruh tisu menunjukkan kepekatan kompleks Pt (IV) yang lebih besar di permukaan atas (iaitu menghadap DC) (Gambar 4).

Pengumpulan sel [14 C] -Pt (IV) dalam analisis MCL: SRIXE. Selepas ujian pengangkutan MCL diproses, tertanam dalam lilin dan 20 μbahagian m melalui MCL digambarkan dalam sinar x-ray synchrotron menggunakan SRIXE. Gambar yang sesuai dari pengagihan unsur dalam segmen MCL yang diolah dengan Pt (IV) dan kawalan MCL yang tidak dirawat ditunjukkan. Skala pada sumbu mewakili bilangan piksel, di mana setiap piksel adalah 3 × 2 μm (mendatar x menegak). Gambar menunjukkan kepekatan elemen relatif, menggunakan skala warna yang ditunjukkan, yang berkisar dari biru, mewakili tahap rendah, hingga merah, mewakili tahap elemen tinggi. Anak panah menunjukkan kedudukan membran PTFE yang menyokong MCL (ditunjukkan dalam Rajah 1D).

Kuantiti pengumpulan sel [14 C] -Pt (IV) dalam MCL. Kandungan platinum permukaan yang terdedah kepada DC dan RC diukur dan dinormalisasi berbanding dengan kawasan yang mewakili keseluruhan MCL. Nilai dinyatakan sebagai peratusan, di mana nilai 100 menunjukkan kandungan unsur yang sama dengan nilai keseluruhan MCL. Data mewakili min dan s.e. dikaitkan dengan dua imbasan.

Kesan tekanan hidrostatik pada fluks [14 C] -Pt (IV) melalui MCL

Sebatian enam-koordinat Pt (IV) telah diusulkan untuk menunjukkan kemungkinan penurunan yang lebih besar terhadap spesies Pt (II) aktif dalam lingkungan mikro intratumour yang bermusuhan. Oleh itu, memastikan penembusan ubat Pt (IV) yang mencukupi ke lapisan tumor yang lebih dalam tetap menjadi isu utama. Salah satu cara yang dicadangkan untuk meningkatkan penembusan adalah dengan meningkatkan tekanan hidrostatik untuk mengatasi peningkatan tekanan interstisial yang dihasilkan pada tumor. Sistem MCL (Gambar 1) menyediakan kaedah yang mudah untuk menyiasat sama ada tekanan hidrostatik dapat memodulasi fluks [14 C] -Pt (IV) melalui tisu tumor pepejal. Tekanan hidrostatik dapat bervariasi dengan hanya mengubah kadar bendalir di DC dan RC dan diterapkan pada arah yang sama dan berlawanan dengan kecerunan konsentrasi sistem MCL. Gambar 5 menunjukkan jumlah kumulatif [14 C] -Pt (IV) yang telah menembus melalui MCL ke RC yang lebih rendah, berbanding dengan jumlah ubat yang ditambahkan awalnya ke DC. Pada tekanan hidrostatik −3 mm H2O (iaitu terhadap gradient kepekatan), jumlah penembusan dikurangkan dari 0,82 ± 0,01 menjadi 0,73 ± 0,01%. Sebaliknya, tekanan hidrostatik meningkat menjadi +4 mm H2O (iaitu sepanjang kecerunan kepekatan), fluks [14 C] -Pt (IV) meningkat kepada 1.06 ± 0.08%. Oleh itu, data menunjukkan bahawa walaupun kecerunan tekanan hidrostatik yang relatif kecil dapat mempengaruhi pengaruh fluks [14 C] -Pt (IV) melalui model tumor MCL.

Kesan tekanan hidrostatik pada kinetik fluks dalam MCL. Tekanan hidrostatik diterapkan dengan mengubah volume medium yang ditambahkan ke DC dan RC seperti yang dijelaskan dalam Bahan dan Metode. Kinetik fluks [14 C] -Pt (IV) ditentukan dan kepekatan RC kumulatif yang berkaitan dengan nilai hanya penyebaran ditunjukkan sebagai min ± s.e.m sekurang-kurangnya tiga eksperimen bebas. * Perbezaan signifikan secara statistik (P& lt0.05).


Kinetik pengangkutan nuklear in vivo di Saccharomyces cerevisiae

Kami telah menerangkan ujian pendarfluor langsung untuk mengukur kadar relatif import yang diarahkan NLS dan eksport pasif protein peleburan NLS-GFP dalam ragi. Reka bentuk dan pembinaan pelapor GFP fusion, kualiti spektralnya, ukuran, penggunaan promotor yang dapat diinduksi, dan pilihan NLS, adalah pemboleh ubah yang dapat memperluas kegunaan kaedah. Aplikasi masa depan hampir pasti akan menuntut pengukuran kadar pengangkutan dalam sel tunggal menggunakan teknik analisis gambar. Seperti yang berlaku setiap kali proses selular dikaji secara in vivo, sifat pemerdagangan nuklear in vivo NLS-GFP rumit dan kurang difahami. Sebilangan orang akan tertarik dengan ujian kinetik NLS-GFP hanya kerana sedikit yang diketahui mengenai fungsi dan peraturan alat pengangkutan dalam sel hidup. Pada masa yang sama, ketidakpastian yang menyertai kerja in vivo semestinya menghalang penafsiran data yang ketat, yang diharapkan oleh ahli biokimia dari eksperimen yang dilakukan secara in vitro menggunakan enzim yang sangat disucikan.


Dua pengangkut fosfat beras, OsPht12 dan OsPht16, mempunyai fungsi dan sifat kinetik yang berbeza dalam pengambilan dan translokasi

Pengangkut fosfat tumbuhan (Pi) memediasi pengambilan dan translokasi nutrien ini di dalam tanaman. Sebanyak 13 urutan dalam genom beras (Oryza sativa) dapat dikenal pasti sebagai milik keluarga pengangkut Pi (Pht1). Di sini, kami melaporkan mengenai corak ekspresi, sifat biologi dan peranan fisiologi dua anggota keluarga: OsPht12 (OsPT2) dan OsPht16 (OsPT6). Ekspresi kedua-dua gen meningkat dengan ketara di bawah kekurangan Pi pada akar dan pucuk. Dengan menggunakan tanaman padi transgenik yang mengekspresikan gen pelapor GUS, yang didorong oleh penganjurnya, kami mengesan bahawa OsPT2 dilokalkan secara eksklusif di batang akar primer dan lateral, sedangkan OsPT6 dinyatakan dalam sel epidermis dan kortikal dari akar primer dan lateral yang lebih muda. OsPT6, tetapi bukan OsPT2, dapat melengkapkan mutan pengambilan Pi yis dalam julat kepekatan tinggi. Oosit Xenopus yang disuntik dengan OsPT2 mRNA menunjukkan peningkatan pengumpulan Pi dan depolarisasi yang berpotensi Pi dari potensi elektrik membran sel, apabila dibekalkan dengan kepekatan luaran mM. Kedua-dua hasil menunjukkan bahawa OsPT2 memediasi pengambilan Pi dalam oosit. Dalam padi transgenik, penurunan antara ekspresi OsPT2 atau OsPT6 oleh gangguan RNA secara signifikan mengurangkan penyerapan dan pengangkutan Pi jarak jauh dari akar ke pucuk. Secara keseluruhan, data ini menunjukkan OsPT6 memainkan peranan yang luas dalam pengambilan Pi dan translokasi di seluruh kilang, sedangkan OsPT2 adalah pengangkut Pi afinitas rendah, dan berfungsi dalam translokasi Pi yang tersimpan di kilang.


Tonton videonya: Meghitung dan Membandingkan Besar Energi Potensial, Energi Kinetik, dan Energi Mekanik (Disember 2021).