Maklumat

Di mana saya boleh mendapatkan sampel virophage Sputnik?


Saya sedang mengusahakan projek di mana saya cuba menggunakan virofag sebagai vektor virus dalam memperkenalkan protein CRISPR-Cas ke dalam virus lain. Saya tertanya-tanya di mana saya mungkin dapat menemui virophages Sputnik yang cacat replikasi atau virophages lain untuk eksperimen semacam ini?


Virophage Zamilon

Virus yang bergantung kepada Mimivirus Zamilon, atau Zamilon, adalah virophage, sekumpulan virus DNA kecil yang menjangkiti protista dan memerlukan virus pembantu untuk meniru mereka adalah sejenis virus satelit. [2] Ditemui pada tahun 2013 di Tunisia, menjangkiti Acanthamoeba polyphaga amoebae, Zamilon menyerupai Sputnik, virophage pertama yang ditemui. Nama itu Arab untuk "jiran". [3] Partikel sferanya berdiameter 50-60 nm, dan mengandung genom DNA untai berkembar sekitar 17 kb, yang diperkirakan akan menyandikan 20 polipeptida. Tekanan yang berkaitan, Zamilon 2, telah dikenal pasti di Amerika Utara.

Semua virofag yang diketahui berkaitan dengan pembantu dalam keluarga virus DNA gergasi Mimiviridae. Zamilon dibatasi dalam rangkaian virus pembantu yang dapat disokong oleh virus dari Mimivirus-seperti Mimiviridae garis keturunan B dan C, tetapi tidak berasal dari garis keturunan A. Ini nampaknya merupakan akibat dari sistem imun yang tidak sempurna dari virus pembantu, yang disebut sebagai MIMIVIRE (elemen ketahanan virophage mimivirus), mirip dengan jalur CRISPR-Cas. [4] Tidak seperti virophage Sputnik, Zamilon nampaknya tidak mengganggu replikasi virus pembantunya.


Artikel PENYELIDIKAN ASAL

Kata Mougari 1, Meriem Bekliz 1, Jonatas Abrahao 1,2, Fabrizio Di Pinto 1, Anthony Levasseur 1 * dan Bernard La Scola 1 *
  • 1 MEPHI, APHM, IRD 198, Jabatan Perubatan, Jangkitan IHU-M & # x00E9diterran & # x00E9e, Universiti Aix-Marseille, Marseille, Perancis
  • 2 Laborat & # x00F3rio de V & # x00EDrus, Instituto de Ci & # x00EAncias Biol & # x00F3gicas, Departamento de Microbiologia, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Brazil

Virofag adalah pengatur kritis dinamika populasi virus dan pelaku berpotensi dalam kestabilan rangkaian mikroba. Entiti biologi kecil ini mendahului kitaran replikasi virus gergasi, seperti anggota Mimiviridae keluarga atau saudara mereka yang jauh, yang menghasilkan dalam sitoplasma sel inang mereka kilang virus yang menyimpan biokimia kompleks yang sesuai dengan pertumbuhan parasit yang lebih kecil. Dalam makalah ini, kami menjelaskan pengasingan dan pencirian virofag baru, yang kelapan, yang kami namakan Guarani. Kami memerhatikan bahawa Guarani memperlihatkan kitaran replikasi yang lewat berbanding dengan host virus gergasi. Di samping itu, seperti semua strain Sputnik, Guarani dapat menjangkiti tiga keturunan A, B dan C dari Mimiviridae keluarga, dan mempengaruhi replikasi dan infektiviti virus inangnya. Dari segi kandungan genetik, Guarani mempunyai genom DNA dua helai panjang 18,967 bp yang mengekod 22 gen yang diramalkan sangat mirip dengan gen Sputnik, kecuali ORF19 dan ORF12. Yang pertama lebih berkaitan dengan Zamilon sementara yang kedua nampaknya baru. Seni bina genom Guarani berkait rapat dengan strain Sputnik dan Zamilon, menunjukkan asal usul semua virofag ini.


La Scola, B. et al. Virophage sebagai parasit unik mimivirus gergasi. Alam semula jadi 455, 100–104 (2008).

Fischer, M. G. & amp Suttle, C. A. Virophage pada asal transposon DNA besar. Sains 332, 231–234 (2011).

Desnues, C. & amp Raoult, D. Di dalam gaya hidup virophage. Intervirologi 53, 293–303 (2010).

Jones, I. M. & amp Reichmann, M. E. Protein yang disintesis dalam daun tembakau yang dijangkiti virus nekrosis tembakau dan virus nekrosis tembakau satelit. Virologi 52, 49–56 (1973).

Parks, W. P. et al. Gangguan virus satelit yang berkaitan dengan Adeno dengan replikasi adenovirus pembantunya. J. Exp. Med. 127, 91–108 (1968).

Murant, A. F. & amp Mayo, M. A. Satelit virus tumbuhan. Annu. Pendeta Phytopathol. 20, 49–70 (1982).

Claverie, J. M. & amp Abergel, C. Mimivirus dan virofaginya. Annu. Pendeta Genet. 43, 49–66 (2009).

Kassanis, B., Vince, D. A. & amp Woods, R. D. Mikroskopi cahaya dan elektron sel yang dijangkiti nekrosis tembakau dan virus satelit. J. Gen. Virol. 7, 143–151 (1970).

den Boon, J. A., Diaz, A. & amp Ahlquist, P. Kompleks replikasi virus sitoplasma. Mikroba Host Sel 8, 77–85 (2010).

Dodds, J. A. Virus mozek tembakau satelit. Annu. Pendeta Phytopathol. 36, 295–310 (1998).

Bringloe, D. H., Pleij, C. W. & amp Coutts, R. H. Analisis mutasi dari cis-lemen di kawasan 3′- dan 5′-tidak diterjemahkan dari virus RNA virus nekrosis tembakau satelit. Virologi 264, 76–84 (1999).

Fischer, M. G. et al. Virus raksasa dengan pelengkap gen yang luar biasa menjangkiti zooplankton laut. Pro. Natl Acad. Sains. USA 107, 19508–19513 (2010).

Sun, S. et al. Kajian struktur virophage Sputnik. J. Virol. 84, 894–897 (2010).

Krupovic, M. & amp Bamford, D. H. Evolusi virus: sejauh mana garis keturunan virus b-barel meluas? Nature Rev. Microbiol. 6, 941–948 (2008).

Rice, G. et al. Struktur virus archaeal termofilik menunjukkan jenis kapsid virus DNA untai ganda yang merangkumi semua bidang kehidupan. Pro. Natl Acad. Sains. USA 101, 7716–7720 (2004).

Comeau, A. M. et al. Meneroka virosfera prokariotik. Res. Mikrobiol. 159, 306–313 (2008).

Krupovic, M. & amp Bamford, D. H. Memesan ke alam semesta yang viral. J. Virol. 84, 12476–12479 (2010).


Perbincangan

Virophages baru-baru ini dijumpai entiti virus yang memerlukan virus gergasi untuk menjangkiti mikroba eukariotik. Interaksi mereka yang rumit menjadikan mereka sangat sukar untuk diasingkan di makmal dan hanya terdapat beberapa wakil terpencil yang berasal dari eksperimen kultur. Untuk mengatasi rintangan pengenalan eksperimental virofag dan meneroka pelbagai kepelbagaian filogenetik dan habitatnya, kami mengembangkan pendekatan komputasi untuk memanfaatkan maklumat yang terdapat di lebih dari 14.000 sampel metagenomik. Pendekatan kami bergantung pada ketersediaan pengekodan gen virophage unik dan terpelihara untuk protein kapsid utama (MCP). Melalui proses berulang, model HMM khusus MCP dikembangkan yang membawa kepada pengenalpastian dan pencirian ratusan genom virofag berkualiti tinggi (HQ) di sebilangan besar habitat. Walaupun hasilnya mungkin berat sebelah kerana terlalu banyak perwakilan MCP dari virofag yang diterbitkan yang terdapat di habitat akuatik dan metadata sampel dari pangkalan data yang dianalisis (contohnya, taburan habitat dan teknologi penjujukan / pemasangan yang digunakan), tinjauan global terhadap virofag yang diaktifkan oleh ini pendekatan boleh membawa kepada pemahaman yang lebih baik mengenai biologi virofag, kepelbagaian habitat, taksonomi, dan evolusi.

Sebelum kerja ini, hanya 33 genom virofag HQ dari kedua-dua isolat dan genom yang berasal dari metagenome yang dikenal pasti dan diklasifikasikan sebagai anggota Lavidaviridae keluarga. Di bawah tahap keluarga, klasifikasi virofage bergantung pada kehadiran "sekurang-kurangnya beberapa gen morfogenetik yang dipelihara dalam virofag (MCP, mCP, ATPase, PRO)" dan "pergantungan atau perkaitan virus dengan NCLDV." Pengelasan ini menghasilkan dua genera yang terpisah (genus Sputnikvirus dan genus Mavirus) [10]. Di samping itu, dikemukakan bahawa virofag yang berasal dari metagenome lain yang diketahui (OLV, YSLV, dan virofag rumen) cenderung diklasifikasikan dalam genera yang berbeza, tetapi ketiadaan replikasi mengasingkan membatasi klasifikasi mereka oleh ICTV. Kajian biogeografi sebelumnya menggunakan MCP separa dari virofag yang diketahui untuk carian berdasarkan homologi untuk mencadangkan pengedaran global merentasi mikrobiom [13]. Walau bagaimanapun, pengenalan genom virofag HQ sangat terhad dan berat sebelah terhadap persekitaran akuatik [13, 15,16,17].

Kajian ini mendedahkan bahawa sebilangan besar kluster protein virophage (VpPC) dikongsi oleh kurang dari 5% genom, menunjukkan kepelbagaian genetik yang sangat besar yang dapat dikaitkan dengan kedudukan evolusi virophage dan frekuensi tinggi pertukaran gen mendatar dengan virus lain entiti dan sel mikrob [43]. Walau bagaimanapun, empat keluarga gen teras yang dicadangkan sebelumnya hadir di antara semua genom lengkap yang baru dikenal pasti, termasuk genom virofag yang berkaitan dengan ruminan di mana mCP sebelumnya dilaporkan hilang [18]. Penemuan ini penting untuk skema klasifikasi baru yang dicadangkan untuk virofag HQ yang diturunkan oleh mikrobioma yang berdasarkan pada homologi urutan dan sinen gen dari VpPC yang dipelihara. Pendekatan kami mendedahkan bahawa 17 dari 27 kumpulan yang dicadangkan adalah novel, sementara 10 yang lain (berkaitan dengan virophages yang diterbitkan dan sesuai dengan klasifikasi sebelumnya) diperluas dengan urutan baru. Klasifikasi ini selanjutnya disokong oleh jenis MCP, taburan jenis habitat, dan kandungan gen keseluruhan anggota clade (Gambar 3) dan menunjukkan peningkatan yang besar dalam kepelbagaian kumpulan taksonomi yang berbeza yang ditentukan oleh urutan genom virofage HQ.

Sampel air tawar terus menjadi habitat dengan jumlah virophage terbanyak dan masih menjadi takungan dengan bilangan urutan MCP terbanyak dalam kelompok tanpa genom HQ. Sebagai contoh, 80% dan 75% virophage dari kluster 19 dan 24 (masing-masing 764 dan 2455 anggota MCP) ditemui dari sampel air tawar (Gambar 2a). Sebagai tambahan, untuk pertama kalinya, kami menemui genom virofage HQ di pelbagai habitat lain termasuk yang berkaitan dengan tumbuhan, mata air termal, permukaan bawah tanah, rumen sapi, dan sampel usus manusia. Yang sangat menarik adalah kes virofag yang berkaitan dengan usus manusia, yang dicirikan oleh model MCP yang agak berbeza (Gamb. 4c). Empat daripada lima genom virofag HQ yang berkaitan dengan manusia dikenal pasti dalam sampel tinja yang pulih dari individu yang mempunyai gaya hidup luar bandar, dengan genom yang tersisa dijumpai pada individu dengan kolitis ulseratif. Oleh itu, virofag ini dapat dihubungkan dengan pengambilan eukariota uniselular dengan makanan atau air. Pemerhatian ini juga disokong oleh penyebaran model MCP yang terdapat dalam sampel tinja dari individu dengan gaya hidup luar bandar, yang dikongsi terutamanya dengan haiwan (babun, lembu, domba, dan arthropoda) dan sumber air tawar (Gambar 2c).

Walaupun terdapat kebolehubahan kandungan protein yang luar biasa yang dikodekan oleh genom virofag yang diramalkan, garis keturunan ini dicirikan oleh adanya blok sinenik dari 4-5 gen yang terdapat di pelbagai genom dari bahagian jauh pokok virophage yang menunjukkan bahawa gen ini diwarisi secara vertikal dari nenek moyang biasa. Walau bagaimanapun, variasi sinten dalam blok ini antara clad virophage yang dicadangkan adalah menunjukkan penyusunan semula genom yang ketara.

Sejumlah VpPC (misalnya, integrase, metilase, rekombinase, dan DNA polimerase) mempunyai homolog dalam virus di luar garis keturunan virofag, terutama pada virus polinton dan polinton. Ini menunjukkan pemindahan gen yang kerap antara pelbagai jenis elemen genetik bergerak, seperti yang sebelumnya dihipotesiskan [22, 44]. Ini juga disokong oleh filogeni DNA polimerase jenis B dan integrase rve yang menunjukkan kluster campuran yang mengumpulkan virofag, polinton, dan virus seperti polinton (Fail tambahan 2: Gambar S2). Dari kumpulan gen ini, yang menarik adalah kehadiran integrase, recombinases, dan transfer RNA di virophages. Integrase dan recombinases dikenal pasti di sebilangan besar clad virophage yang dicadangkan (Fail tambahan 1: Jadual S4 Fail tambahan 1: Jadual S5), kemungkinan memberikan virus tersebut dengan kemampuan untuk memasukkan DNA mereka ke dalam genom host sebagai provirophages. Integrasi sebelum ini digambarkan untuk Mavirus dan Natans Bigelowiella virophages [7, 42, 45] dan dapat memberikan perlindungan yang berpotensi untuk host eukariotik terhadap NCLDV [42]. Sebaliknya, ini adalah kali pertama urutan tRNA dikenal pasti dalam genom virofag (Fail tambahan 2: Gambar S6). Kehadiran mereka dapat membantu virofag untuk melengkapkan penggunaan kodon atau asid amino host mereka [32, 33] atau mungkin hasil pemerolehan dari genom inang kerana tRNA dikenali sebagai tempat panas untuk penyatuan virus [32, 34, 35].

Akhirnya, pendekatan komputasi berasaskan novel MIMIVIRE untuk meramalkan kaitan virofag dengan virus gergasi mendedahkan keturunan virus raksasa novel yang berpotensi disasarkan oleh virofag. Di samping itu, analisis transkriptom protozoa memungkinkan pengesanan hubungan tiga antara a Mavirusvirophage yang berkaitan, virus gergasi yang berkaitan dengan CroV, dan dinoflagellate laut A. asam jawa. Kami menjangkakan bahawa data ini akan mendorong reka bentuk eksperimen lebih lanjut dan pengesahan ramalan komputasi triplet virophage-virus-microeukaryote dan menjelaskan evolusi dan ekologi sistem biologi yang luar biasa ini.


Penyemak & # x02019 laporan

Penyemak 1

Mart Krupovic, Institut Pasteur

Dalam Catatan Penemuan ini, Yutin et al. terangkan kumpulan virofagatif yang baru, yang mereka temui dalam metagenome rumen domba. Unsur-unsur baru ini jauh berbeza dengan virofag yang dijelaskan sebelumnya dan nampaknya mengandungi genom chimeric. Modul morfogenesis virion serupa dengan yang dimiliki oleh semua virofag, sedangkan polimerase DNA keluarga B lebih berkait rapat dengan protein sepadan dengan transposon DNA besar, seperti virus dari keluarga super Polinton / Maverick. Penulis berjaya mengumpulkan beberapa genom yang hampir lengkap dari virofag novel ini. Metagenome yang mengandung virophage positif untuk kehadiran mimivirus, seperti yang dinilai oleh terjadinya pembacaan kod untuk protein kapsid utama mimivirus. Hasil ini selaras dengan kesimpulan bahawa virofag yang baru dikenal pasti parasit pada virus gergasi. Manuskrip ditulis dengan sangat jelas dan logik.

Dengan menggunakan urutan protein kapsid utama yang ditunjukkan dalam fail Tambahan 1, saya dapat mengesahkan hubungan antara protein kapsid virofagus rumen dengan virofag yang dijelaskan sebelumnya. Namun, saya tidak dapat mengakses genomik metagenome usus. Adalah wajar untuk menunjukkannya sebagai fail GenBank yang diarkibkan dalam maklumat tambahan.

Modul morfogenetik virofag dan polinton merangkumi protein kapsid minor. Adakah virophage rumen mengekod homolog protein ini? Ini mesti dinyatakan dalam teks.

Respons pengarang & # x02019: Ini adalah perkara penting yang dibahas secara eksplisit dalam naskah yang disemak semula. Nampaknya RVP benar-benar kekurangan protein kapsid kecil.

Separuh kedua ayat ketiga mungkin merupakan keterangan yang berlebihan.

Respons pengarang & # x02019: Ya, pengulas kedua juga membuat komen yang serupa. Kami mengubahsuai ayat untuk menunjukkan bahawa virus chimeric & # x0201cmight & # x0201d menjadi komponen utama virom.

& # x0201cof dua keluarga yang berbeza & # x0201d bertukar kepada & # x0201ckeluarga & # x0201d.

Respons pengarang & # x02019: diperbetulkan

& # x0201menambah lipatan jeli-roll yang diturunkan & # x0201d berubah menjadi? menggunakan lipatan jeli bergulung yang diturunkan & # x0201d.

Respons pengarang & # x02019: diubah suai seperti yang dicadangkan.

Dalam perenggan terakhir Penemuan (sebelum kesimpulan), perlu disebutkan bahawa walaupun genom Mavirus telah dilaporkan sebagai molekul bulat, ia mengandungi ulangan terbalik 50 & # x000a0bp (dipisahkan oleh 15 & # x000a0bp) (rujuk 12 dalam arus senarai rujukan), yang sesuai dengan pengulangan terbalik terminal yang terdapat dalam polinton, PGV dan RVP.

Tanggapan pengarang & # x02019: Dengan mempertimbangkan format Biologi Direct, kami percaya bahawa memadai untuk memasukkan perincian ini di sini. Kami menghargai pengulas menunjukkannya.

Label beberapa ORF dalam fail Tambahan 3 dibalik.

Respons pengarang & # x02019: Dibetulkan.

Penyemak 2

Kenneth Stedman, Universiti Negeri Portland

Yutin et al., Dalam & # x0201cDiscovery Note & # x0201d mereka telah melakukan carian yang sangat sensitif terhadap set data urutan metagenomik yang tersedia untuk urutan yang serupa dengan gen protein kapsid utama (MCP) virofag yang diketahui. Kemudian mereka menggunakan urutan ini sebagai sauh untuk memperoleh data urutan yang berkaitan dari set data metagenomik. Oleh itu, para penulis menemui sekumpulan urutan baru, yang mana MCP berpotensi serupa dengan MCP virofag tetapi terdiri daripada klade terpisah yang disokong secara filogenetik. Menariknya, sebilangan MCP ini dikaitkan dengan gen polimerase DNA berpotensi protein yang serupa dengan beberapa gen polimerase DNA Polinton. Penulis mencadangkan keluarga virofag baru berdasarkan analisis ini.

Sangat disayangkan bahawa manuskrip ini dibatasi oleh format nota penemuan, kerana saya mendapati angka-angka Tambahan tidak dapat dipisahkan dengan penafsiran hasil yang disajikan dalam manuskrip. Secara khusus, saya mendapati pokok filogenetik untuk gen ATPase dan Protease virus yang berpotensi sekurang-kurangnya meyakinkan seperti pokok filogenetik yang ditunjukkan dalam Rajah & # x000a0 1. Peta genom dalam fail Tambahan 3 juga sangat berguna untuk memahami naskah dan menyokong hipotesis pengarang.

Respons pengarang & # x02019: Kami menghargai pemikiran ini tetapi berpendapat bahawa format Discovery Note paling sesuai untuk penemuan ini. Sebab utama adalah bahawa kita tidak mengesahkan urutan genom RVP yang lengkap dan tidak berpeluang untuk melakukan urutan pengesahan seperti yang ditunjukkan oleh pengulas di bawah. Oleh itu format komunikasi pendek nampaknya merupakan pilihan yang tepat. Kami bersetuju bahawa pokok untuk ATPases dan protease sama meyakinkannya dengan pokok pPolB dan mungkin lebih senang ditafsirkan. Kami telah memilih polimerase untuk badan utama artikel kerana secara keseluruhan, gen ini lebih umum di antara unsur genetik yang berbeza daripada kedua-dua gen yang lain. Sepengetahuan kami, fail tambahan adalah bahagian tidak terpisahkan dari makalah yang diterbitkan dan boleh diakses dari artikel dengan satu klik. Oleh itu, kami berharap dan percaya bahawa tidak ada masalah bagi pembaca dalam menilai keseluruhan bukti yang dikemukakan di sini.

Gambar & # x000a0 2 dengan pohon filogenetik DNA polimerase prima protein membingungkan, kerana kepelbagaian pPolBs di Polintons. Saya sangat mengesyorkan pengenalan yang lebih luas kepada Polinton dan pPolB mereka yang pelbagai. Saya juga fikir ini akan membantu penafsiran angka tersebut.

Respons pengarang & # x02019: Kami tidak begitu pasti mengenai punca kekeliruan itu. Berpotensi, masalahnya mungkin terletak pada kenyataan bahawa kumpulan virus eukariotik yang berlainan dan unsur egois lain muncul dari dalam kepelbagaian polinton. nampaknya berkembang dari kumpulan polinton yang berlainan. Kami menekankan trend ini di dua tempat dalam naskah yang disemak semula. Di luar penjelasan ini bahawa, seperti yang kita harapkan, cukup untuk menghindari kekeliruan, sepertinya tidak ada ruang dalam naskah ringkas ini untuk memperkenalkan polinton dengan lebih terperinci.

Saya, dan saya rasa kebanyakan pembaca Biologi Direct, ingin lebih terperinci mengenai beberapa kaedah, dan beberapa penjelasan mengenai beberapa pernyataan dalam naskah. Ini diperincikan di bawah:

Pertama, walaupun makmal kami adalah yang pertama mengenali mereka, saya tidak pasti sama ada virus ssDNA chimeric dan & # x02009 + & # x02009strand RNA adalah & # x0201cm komponen virom & # x0201d. Saya ingin berfikir bahawa mereka begitu. Namun, kerana sebilangan besar virom yang dikutip, dan tentu saja milik kita, diperkuat menggunakan polimerase Phi29DNA, yang secara khusus memperkuat genom virus ssDNA kecil, seseorang tidak dapat memastikan pengukurannya. Mungkin ini dibincangkan dalam Krupovic et al., Genome Biology and Evolution, 2015, tetapi saya tidak dapat mengakses naskah ini.

Respons pengarang & # x02019: ini adalah perkara utama dalam artikel ini. Kami mungkin sudah terlampau dalam versi asal. Kenyataan itu dilembutkan dalam penyemakan berikutan komen ini dan komen serupa dari pengulas 1.

Dalam ayat kedua perenggan kedua & # x0201cFindings & # x0201d, saya cadangkan untuk menambahkan & # x0201cknown & # x0201d selepas & # x0201cThe & # x0201d dan sebelum & # x0201cvirophages & # x0201d dan menukar & # x0201ckilobases & # x201 & # x201 & # x20 .

Respons pengarang & # x02019: diubah suai seperti yang dicadangkan.

Perenggan ketiga Penemuan: Pertimbangkan untuk memasukkan rujukan ke transposon Maverick pada sebutan pertama Polintons untuk menjelaskan ini bagi para penyelidik yang belum dapat mengikuti literatur baru-baru ini oleh penulis (dan yang lain) mengenai Polintons.

Perenggan kelima & # x0201cFindings & # x0201d: Definisi & # x0201chits & # x0201d perlu dibuat di sini atau parameter tepat yang digunakan untuk carian dan kriteria pemilihan yang diberikan. Saya melakukan carian tBLASTn dengan urutan MCP pertama yang disenaraikan (Mavirus MCP) menggunakan id taksonomi metagenome dan mendapati & # x0201chits & # x0201d dengan nilai e-tinggi dan skor rendah. Saya juga akan menyenaraikan id metagenom yang terdapat di sini, dan bukannya singkatan. Saya tidak bersetuju bahawa analisis ini & # x0201confirmated & # x0201d mungkin, saya akan mengatakan & # x0201dikenal pasti & # x0201d.

Respons pengarang & # x02019: Kami menunjukkan dalam semakan bahawa pada peringkat pertama, kami menggunakan lalai BLAST, iaitu E-value & # x02009 & # x0003c & # x0200910 (tidak ada kepentingan statistik yang diperlukan). & # x0201cDikonfirmasi & # x0201d diubah menjadi & # x0201dikenal pasti & # x0201d seperti yang dicadangkan. Walau bagaimanapun, kami berpendapat bahawa di sini id taksonomi tidak perlu mengacaukan teks, singkatan sudah cukup. Nilai e, skor dan ID hit terbaik, serta ID urutan metagenomik, terdapat dalam fail Tambahan1.

Perenggan keenam dari & # x0201cFindings & # x0201d: Perkaitan antara MCP virophage seperti Sputnik dengan MCP virophage dugaan rumen domba kelihatan sangat lemah dari Gambar & # x000a0 1. Adakah nilai (39) disenaraikan di titik cabang di pokok di antara dua kumpulan ini betul? Dalam tafsiran saya ini bermaksud pengelompokan yang berlainan 61% dari masa, mungkin pemahaman saya mengenai nilai ELW ini tidak betul. Adakah semua pertunjukan panjang dalam metagenome rumen domba dianalisis di sini atau hanya yang mengandungi gen MCP virofagatif? Sekiranya semua babi panjang sesuai dengan RVP, maka itu mungkin sangat biasa di persekitaran rumen domba.

Respons pengarang & # x02019: tafsiran ELW pada dasarnya betul. Namun, pohon-pohon itu dibuat semula dengan kaedah yang berbeza, dan berdasarkan hasil yang disertakan dalam versi yang disemak semula, kami tidak lagi menuntut hubungan dengan keluarga Sputnik. Kami menganalisis semua kontigen metagenome rumen domba yang disimpan di GenBank pada saat penyerahan naskah ini (BioProject PRJNA202380 5.8 gbp 8,786,927 contigs <"type": "entrez-nucleotide", "attrs": <"text": "AUXO000000000.1", "term_id": "608786013", "term_text": "AUXO000000000.1" >> AUXO000000000.1http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/wgs/?val=AUXO01#contigs), dan bahagian yang diperincikan dalam fail Tambahan3adalah satu-satunya protein yang berkaitan dengan virophage. Oleh itu, RVP tidak biasa terjadi pada rumen domba.

Perenggan ketujuh: Perhimpunan metagenomik yang ditunjukkan dalam Fail tambahan 3 sangat menarik dan cukup meyakinkan. Walau bagaimanapun kaedah mesti dijelaskan bagaimana cara pemasangan ini. Nampaknya mereka berkumpul dengan berbagai cara.

Respons pengarang & # x02019: Perhimpunan yang dilaporkan di sini diperoleh menggunakan carian BLASTN seperti yang dilaksanakan di Censor. Legenda tokoh terperinci dimasukkan dalam fail Tambahan yang disemak semula3. setiap contig yang mengekodkan homolog MCP digunakan sebagai pertanyaan dalam carian Sensor terhadap set lengkap semua kontigen metagenome rumen domba (8,786,927 babi, 5,8 Gbp). Dengan menggunakan Sensor, kami tidak menjumpai pertindihan termini virofag yang disatukan dengan contig lain.

Perenggan kelapan: Saya tidak setuju bahawa kumpulan RVP viratif yang berpotensi berkaitan & # x0201dengan jelas & # x0201d dengan virofag seperti Sputnik (berdasarkan Gambar & # x000a0 1, jika fail Tambahan 2 ditambahkan ini akan menjadikan argumen menjadi lebih kuat).

Respons pengarang & # x02019: Kami telah membuat semula pokok dan membuang penyataan yang dinyatakan. Yang benar-benar jelas, adalah hubungan modul morfogenetik RVP dengan hubungan virofag (secara umum). RVP adalah keluarga virofag baru yang berbeza. Teks tersebut diubah suai dengan sewajarnya.

Perenggan kesembilan: Kemungkinan hubungan antara RVP dan urutan mimivirus dalam metavirome jelas bersifat spekulatif, tetapi ada sebutan yang harus dibuat di sini sama ada virus ini mungkin endogen atau sesuatu yang dimakan oleh domba. Pernyataan & # x0201terutama banyak & # x0201d tidak tepat, beberapa pengukuran, sekurang-kurangnya relatif terhadap metagenom lain, harus diberikan di sini.

Respons pengarang & # x02019: Memandangkan sejauh ini virofag telah terbukti hanya mem parasit virus raksasa keluarga Mimiviridae, kami menganggap hubungan antara RVP dan mimivirus yang nampaknya terdapat di habitat yang sama, dinilai dari analisis metagenome, sangat masuk akal walaupun, tentu saja , masih merupakan dugaan. Kemungkinan bahawa mimivirus berasal dari makanan dan tidak membiak di rumen sukar difahami memandangkan diet domba yang hampir kaya dengan amuba. & # x0201cTerutama banyak & # x0201d berkaitan dengan nisbah MCP seperti Mimiviridae yang diperpanjang dalam metagenome rumen dibandingkan dengan metagenom lain yang dianalisis untuk perkara ini, seperti yang ditunjukkan dalam fail Tambahan1. Kami tidak fikir nombornya perlu disertakan dalam artikel. Pembaca yang sangat berminat dapat mengira menggunakan Fail tambahan1.

Perenggan kesepuluh: Analisis TIR juga harus mencakup analisis IR internal, jika ada, dalam urutan. Sekiranya bacaan urutan metagenomik asal tersedia, ini dapat mengatasi sama ada IR yang dikenal pasti sebenarnya terminal. Saya akan menerangkan mengenai virofagatif PGV dengan lebih terperinci, adakah ia hanya mempunyai TIR tetapi tidak ada gen lain? Pada akhir perenggan, saya yakin penulis bermaksud & # x0201cin trans & # x0201d dan bukannya & # x0201cin-trance & # x0201d.

Respons pengarang & # x02019: Tidak ada IR dalaman. Penjelasan mengenai protein yang dikodkan virophage PGV ditambahkan. Kesalahan typo itu diperbetulkan.

Kesimpulan: Saya sangat setuju dengan potensi metagenom yang luar biasa sebagai sumber genom virus baru. Harus disebutkan bahawa, dalam kasus virus ssDNA chimeric, banyak dari mereka telah disahkan semula oleh penguatan dan hasil dari sampel asal, yang saya tidak percaya telah dilakukan untuk RVP ini.

Respons pengarang & # x02019: Tidak semestinya ada penguatan dan penambahbaikan yang berlaku di sini. Namun, kami tidak percaya penafian ini termasuk dalam Kesimpulan. Cukuplah di sini untuk dilihat oleh pembaca yang berminat.

Kaedah: Untuk carian pangkalan data nr, adakah semua klik MCP yang disangka dicari secara individu atau sebagai urutan konsensus atau HMM? Sila jelaskan. Bagaimana nilai sokongan cawangan dikira?

Respons pengarang & # x02019: Urutan individu digunakan sebagai pertanyaan untuk carian pangkalan data. Baik Tblastn maupun Blastp tidak berfungsi dengan profil, jadi ini jelas seperti yang ditulis. Hukuman mengenai sokongan cawangan telah diubah.

& # x0201cSumbangan pengarang & # x0201d dan & # x0201cPengakuan & # x0201d nampaknya diduplikasi dalam naskah.

Respons pengarang & # x02019: Dibetulkan.

Gambar legenda: Saya cadangkan membuang & # x0201cEvolusi evolusi virophages rumen & # x0201d dari kedua tajuk gambar.

Respons pengarang & # x02019: selesai, dengan pengubahsuaian tambahan.

Saya juga mencadangkan membelah legenda daripada meletakkan semua pada Gambar & # x000a0 1, kerana Gambar & # x000a0 1 tidak mempunyai cabang multifungsi atau runtuh.

Sejumlah singkatan hilang dalam legenda ini, seperti ALM, YSLV, ATP, PRO, MCP, dan pPOLB (dan E8 dari Gambar & # x000a0 2).

Respons pengarang & # x02019: termasuk

Tidak jelas bagi saya bahawa nilai bootstrap kurang dari 50% dijadikan multifungsi, kerana 18, 31, 37, dan 39 disenaraikan. Sekiranya ELW bukan tali boot, ini harus dijelaskan dalam legenda atau teks atau kedua-duanya.

Respons pengarang & # x02019: Multifurcations disebut secara salah & # x02013 dikeluarkan. ELW boleh ditafsirkan sebagai bootstrap.

Tidak jelas ORF mana yang dimaksudkan dalam urutan YSLV, saya akan memasukkan nombor aksesi untuk semua urutan individu yang ditunjukkan di pokok.

Respons pengarang & # x02019: termasuk

Orientasi kartun untuk RVP nampak rawak, saya akan mengorientasikan semuanya dengan cara yang sama, kecuali untuk yang jelas berbeza kerana orientasi relatif gen pPolB. Saya juga akan mengenal pasti mana yang mengandungi TIR.

Respons pengarang & # x02019: Ya, ini adalah cadangan yang sangat baik. Kartun disusun semula berdasarkan orientasi gen MCP. TIR tidak berdekatan dengan gen terpelihara ini dan karenanya ditunjukkan dalam fail Tambahan3.

Fail tambahan 1: Adakah penjelasan dalam jadual ini dari kajian ini?

Respon pengarang & # x02019: ya, betul

Fail tambahan 2: Sertakan dalam manuskrip dan berhati-hati untuk menentukan semua singkatan dan menyenaraikan nombor aksesi.

Sambutan pengarang & # x02019: Tcadangannya tidak sepenuhnya jelas. Sekiranya ini mengenai menjadikannya tokoh utama dan bukannya Fail Tambahan, alasan untuk tidak melakukan ini dijelaskan di atas. Singkatan dan aksesi diperiksa dan dipinda.

Fail tambahan 3: Sama ada memasukkan ORF di A atau berpisah dalam Rajah & # x000a0 1 (atau kedua-duanya).

Respons pengarang & # x02019: Kami memasukkan ORF terpilih dalam virophage A (Fail tambahan3): POLB, ATPase, protease sistein, MCP, dan satu protein yang tidak diklasifikasikan (& # x0201c24 & # x0201d), 15 protein lain yang tidak diklasifikasikan tidak ditunjukkan (ia tidak terdapat dalam virofag lain).


Sputnik pertama kali diasingkan dari sampel yang diperoleh dari manusia dan diambil dari cecair kanta lekap individu dengan keratitis. [3] Secara semula jadi, virophage Sputnik telah ditemukan berkembang biak di dalam spesies Acanthamoeba, tetapi hanya jika amuba itu dijangkiti mamavirus besar. Sputnik memanfaatkan protein mamavirus untuk menghasilkan salinan baru dengan cepat. [1]

Sputnik mempunyai genom DNA untai berkembar yang terdiri daripada 18,343 pasangan asas. [4] Ia mengandungi gen yang mampu menjangkiti ketiga-tiga domain kehidupan: Eukarya, Archaea dan Bakteria. Daripada dua puluh satu gen pengekodan protein yang diramalkan, tiga nampaknya berasal dari APMV itu sendiri, satu adalah homolog dari virus archaeal, dan empat yang lain adalah homolog protein dalam bakteriofag dan virus eukariotik. Tiga belas adalah ORFans, iaitu mereka tidak mempunyai homolog yang dapat dikesan dalam pangkalan data urutan semasa. Genom Sputnik mempunyai kandungan AT yang tinggi (73%) serupa dengan APMV.

Beberapa homolog lain seperti primase-helicase, ATPase pembungkusan, subunit pengikat DNA transposase urutan penyisipan, dan protein pita Zn, dikesan dalam set data persekitaran Global Ocean Survey, menunjukkan bahawa virophages boleh menjadi saat ini keluarga virus yang tidak diketahui.

Sputnik didapati mengandungi gen yang dikongsi oleh APMV. Gen ini mungkin diperoleh oleh Sputnik setelah hubungan APMV dengan host dan kemudian interaksi antara virophage dan virus host. Penggabungan semula di kilang virus mungkin mengakibatkan pertukaran gen. Sputnik adalah salah satu bukti yang paling meyakinkan untuk pencampuran gen dan pemadanan antara virus.

Kehadiran gen ini homolog dengan mimivirus di Sputnik menunjukkan bahawa pemindahan gen antara Sputnik dan mimivirus boleh berlaku semasa jangkitan Acanthamoeba. Oleh itu, dihipotesiskan bahawa virophage dapat menjadi sumber kenderaan yang memediasi pemindahan gen lateral antara virus gergasi, yang merupakan bahagian penting dari populasi virus DNA di lingkungan laut. Moreover, the presence of three APMV genes in Sputnik implies that gene transfer between a virophage and a giant virus is crucial to viral evolution. [6]


PENGENALAN

Virophages, a group of circular double-stranded DNA (dsDNA) viruses, are icosahedral in shape and approximately 50 to 100 nm in size (1𠄴). Virophages have three unique features (2). First, the nuclear phase is absent during the infection cycle of virophages. Second, the replication of virophages takes place in a viral factory of the giant host DNA viruses. Third, they depend on enzymes from host viruses instead of host cells. Accordingly, virophages are considered to be parasites of giant DNA viruses, e.g., mimiviruses and phycodnaviruses (1𠄳). Giant DNA viruses possess huge genome sizes (up to 𢒁,259 kb), some of which are even larger than those of certain bacteria (5𠄷). The infection and propagation of virophages lead to a significant decrease in host virus particles and, consequently, an increase in host cell survival (1𠄳). Additionally, exchanges of genes may occur between virophages and giant DNA viruses (1𠄳, 8, 9). Therefore, virophages are potential mediators of lateral gene transfer between large DNA viruses (8, 9).

Thus far, four virophages have been identified in distinct locations ( Table 1 ). The first reported virophage, Sputnik, was isolated from an Acanthamoeba species infected with the large mamavirus in a water-cooling tower in Paris, France (2). The second virophage, Mavirus, was observed in a marine phagotrophic flagellate (Kafetaria roenbergensis) in the presence of the host virus, Kafetaria roenbergensis virus, originating from the coastal waters of Texas (1, 10). The third virophage, Organic Lake virophage (OLV), discovered in a hypersaline meromictic lake in Antarctica, is thought to parasitize large DNA viruses infecting microalgae (3, 11). At the time of this report, a fourth virophage, Sputnik 2, together with its host virus, Lentille, has been detected in the contact lens solution of a patient with keratitis in France (12). The fact that virophages exist in a wide range of virus and eukaryotic hosts, as well as in a variety of unique habitats, implies the possibility that they are more widely distributed and diverse than previously thought.

Jadual 1

VirophageLokasiHost Genome
VirusEukaryoteSize (bp)No. of ORFsC+G content (%)
SputnikA cooling tower in Paris, FranceAcanthamoeba polyphaga mimivirusA. polyphaga18,3432127.0
MavirusCoastal waters of TexasKafetaria roenbergensis virusMarine phagotrophic flagellate (C. roenbergensis)19,0632030.3
OLVOrganic Lake, a hypersaline meromictic lake in AntarcticaLarge DNA virusesPrasinophytes (phototrophic algae)26,4212639.1
Sputnik 2Contact lens fluid of a patient with keratitis, FranceLentille virusA. polyphaga18,3382028.5
YSLV1Yellowstone LakePhycodna- or mimiviruses?Microalgae?27,8492633.4
YSLV2Yellowstone LakePhycodna- or mimiviruses?Microalgae?23,1842133.6
YSLV3Yellowstone LakePhycodna- or mimiviruses?Microalgae?27,0502334.9
YSLV4Yellowstone LakePhycodna- or mimiviruses?Microalgae?28,3063437.2
ALMAce Lake in Antarcticamimiviruses?Phagotrophic protozoan?17,7672226.7

To obtain greater insight into the unusual diversity of the global distribution and abundance of virophages, in this study, metagenomic databases on the Community cyberinfrastructure for Advanced Microbial Ecology Research and Analysis (CAMERA) 2.0 Portal (https://portal.camera.calit2.net/) (13) were analyzed comprehensively. Four complete genomic sequences of virophages and one nearly complete sequence were assembled based on the metagenomic DNA sequences of Yellowstone Lake, Wyoming, and Ace Lake, Antarctica. Comparative genomics and phylogenetic analyses were performed in order to better understand the genomic sequence features, phylogeny, and evolution of virophages.


Bahan dan Kaedah

Water samples from Organic Lake were collected December 2006 and November and December 2008, and microbial biomass was collected onto 3.0-, 0.8-, and 0.1-μm membrane filters as described previously (14, 36). DNA extraction, sequencing, phylogenetic analyses, generation of metagenomic assemblies and annotation of OLPV and OLV mosaic genomes, and protein extraction and metaproteomic analyses were performed as previously described (14, 36). Unfiltered Organic Lake water samples from 2006 were fixed in formalin 1% (vol/vol), negatively stained, and visualized by TEM for VLPs. A modified Lotka-Volterra model was used to describe algal host, virus, and virophage dynamics, on the basis of approaches previously described (14). Full details are provided in Bahan dan Kaedah SI.


Keputusan dan perbincangan

Overall Structure of the Sputnik Virus.

A 3.5-Å resolution, icosahedrally averaged map (Fig. 1 A–D) was determined by image reconstruction using approximately 12,000 cryo-EM particles. In addition, a 3.8-Å resolution map of empty capsids was calculated using approximately 13,000 empty particles. There are 4 and 1/3 hexon capsomers in each icosahedral asymmetric unit of the virus, where the 1/3 hexon is from a hexon sitting on the icosahedral threefold axis. In addition there is 1/5 of a penton capsomer adjacent to the fivefold vertex in the asymmetric unit. After the hexon and penton densities had been interpreted there remained three similar uninterpreted densities, each representing nine amino acids, presumably corresponding to the same sequence of a minor capsid protein. These densities were located on the inside of the capsid, at the boundary between pairs of hexons (Fig. S1), but are absent in the empty capsids and must have been associated with the DNA so as to be able to exit along with the DNA.

Reconstruction of Sputnik at 3.5-Å resolution. (A) Reconstruction of the whole virus, colored according to radius. (B) Fourier shell correlation (FSC) coefficient plot showing the resolution of Sputnik reconstruction to be 3.5 Å (FSC = 0.143) according to the criterion defined by Rosenthal and Henderson (42). (C) Cryo-EM density of a β-strand in the MCP. (D) Cryo-EM density of selected residues, Phe, Arg, Trp, and Tyr (from left to right), showing the quality of the reconstruction.

Major Capsid Protein.

The structures of the 13 MCPs in the icosahedral asymmetric unit were built independently and then refined with the program CNS (27). The refined structure had an R-factor of 0.26 and 3.8% of residues in disallowed regions of the Ramachandran plot. Root-mean-square deviation of bond lengths from ideal values was 0.012 and that of angles was 1.7. The structure of the first 508 amino acids of each of the MCPs could be easily built using the amino acid sequence corresponding to gene V20 (Fig. 2 A dan B). Residues 497–508 form an α-helix that is inserted into a hydrophobic pocket located in the center of each hexon. There is not enough space for amino acids that follow residue 508 to exit this pocket (Fig. 2C). Furthermore, an SDS/PAGE gel (Fig. 2D) shows that the molecular mass of the MCP is approximately 55 kDa, whereas the calculated molecular mass of the whole protein is 65.4 kDa. Therefore, the last 87 residues of the MCP must have been cleaved off probably during assembly. The overall structure of the MCP is a double jelly-roll fold with the BC, DE, FG, and HI loops pointing toward the quasi-sixfold axis of the capsomer, as in other jelly-roll–containing viral capsomers. Amino acids 1–279 of V20 form the first jelly-roll, and amino acids 280–507 form the second jelly-roll. As in the MCPs of PBCV-1 (Vp54), PRD1 (p3), and the adenovirus hexon, there is a “tower” structure created from the usual large insertions between strands D to E and F to G in both jelly-rolls (Fig. 2B). However, in Sputnik and PRD1 the insertion between strands H and I of the first jelly-roll also contributes to the tower structure. Furthermore, in Sputnik the insertion between strands F and G of the second jelly-roll contributes to the tower of the neighboring molecule.

Double jelly-roll structure of MCP. (A) Ribbon diagram of the Sputnik MCP. The first and second jelly-roll domains are colored green and red, respectively. (B) Diagrammatic representation of the arrangement of β-strands and residue numbers at the ends of the β-strands. (C) Stereo diagram showing the C-terminal region of the MCP. Residues 502–508 are colored orange. These residues bind into a hydrophobic pocket. There is no density or space for the remaining 87 C-terminal residues of the MCP sequence, suggesting that these residues had been cleaved. (D) Molecular mass of the MCP is estimated to be approximately 55 kDa by SDS/PAGE gel.

PBCV-1, PRD1, and vaccinia virus have a viral membrane, and their MCPs have highly positively charged surfaces facing the membrane (Fig. 3A). For Sputnik the surface of the MCP facing the inside of the virus has both negatively and positively charged patches (Fig. 3B) at neutral pH, similar to the charge distribution of the inside surface of the adenovirus hexon protein. Thus, the charge distribution of Sputnik’s MCP indicates that Sputnik probably does not have a viral membrane. The absence of a lipid membrane was further confirmed using paper spray mass spectroscopy (Figs. S2 and S3 Bahan dan Kaedah SI). The ease with which the genome can be persuaded to be ejected from the capsid by changes of pH (see below) also speaks to the absence of a barrier, were a membrane present.

Comparison of the inner surface charge distribution of dsDNA virus MCPs with a double jelly-roll fold. (A) Viruses that have a lipid membrane envelope. (B) Viruses that do not have a lipid membrane envelope.

The region immediately inside the capsid protein appears as three parallel layers, each approximately 25 Å thick, in a 20-Å resolution low-pass filtered map (Fig. S4A). The reconstruction of the empty virus does not have these layers (Fig. S4B). Therefore, the three consecutive density layers within the capsid probably represent ordered or semiordered dsDNA, as is observed for many dsDNA bacteriophages (28, 29). The outermost layer is more intense, presumably because the DNA structure is closely associated with the icosahedral capsid structure. This conclusion contradicts the earlier results (9), based on a 10.7-Å resolution map and mass spectroscopic results, that the density in this region corresponds to a membrane. Although the cause of this discrepancy is unclear, the present mass spectroscopic results have been confirmed by both positive and negative controls using viruses with and without a lipid membrane, respectively (Figs. S2 and S3).

The earlier 10.7-Å resolution study (9) had shown that the external surface of the capsid was decorated with occasional, approximately 100-Å-long, mushroom-like fibers. These features were not visible in the 3.5-Å resolution map, demonstrating that these features are essentially disordered at a resolution of better than 11 Å. It is unknown whether these features are proteins or glycans.

Penton Protein.

The Sputnik cryo-EM density representing the pentons and especially the insertion loops is slightly poorer than that of hexon densities, probably caused by greater flexibility of the penton loops. A Cα atom model was built into the electron density map, identifying the location of approximately 350 amino acids. Because the sequence of the Sputnik penton protein was unknown, a program was designed to align the protein sequences given by the Sputnik genome, expressed in terms of amino acid sizes, with the sizes of the amino acids in the cryo-EM density map (Bahan dan Kaedah SI). A satisfactory alignment was obtained for the approximately 150 N-terminal amino acids of gene product V18 and for the alignment of gene products V19 with the remaining C-terminal residues of the Cα atom penton structural model. In the gene sequencing results (2), there was a frame shift between the V18 and the initial bases of the V19 gene. However, according to the electron density map, the penton structure was only one polypeptide chain. Therefore, when the Sputnik genome was resequenced near the junction of these genes, it was found that the original sequence had one additional erroneous base that created a stop codon for V18. Thus, in the absence of the erroneous base, V18 and the whole V19 sequence were in the same frame without a stop codon between them, making V18 and V19 one V18/19 fusion gene, coding for 379 amino acids. The amino acid sequence was then built into the cryo-EM density except for 11 disordered amino acids at the N terminus and 5 disordered amino acids at the C terminus.

The penton protein folds into two domains: a “lower” domain that has a 184 amino acid jelly-roll structure located toward the interior of the virus, and an “upper” domain consisting of 195 amino acids (amino acids 66–261) located on the surface of the virus around the fivefold vertex (Fig. 4 A dan B). The orientation of the five jelly-roll domains is roughly similar to the orientation of the VP1 subunits in picornaviruses. In Sputnik the β-strands are roughly radial, whereas in picornaviruses the β-strands are somewhat more tangential, but in both cases the BC, DE, FG, and HI loops are closest to the outside of the virus. The upper domain is primarily a β-barrel inserted between β-strands D and E of the lower jelly-roll domain. If the inserted β-strands along the polypeptide are named IA, IB, IC, ID, and IE, then the two β-sheets would consist of strands IB, IC, IE and of IA, ID. An α-helix, lying parallel to the β-strands, links β-strands IA and IB. The mean center position of the upper domain is rotated counterclockwise (seen from outside the virus) by approximately 60° around the fivefold axis, relative to the lower domain, placing the upper domain almost above the lower domain of the neighboring monomer. The penton has a pore along the fivefold axis with a diameter of 7–10 Å near the outside of the virus that is blocked near the base of the lower domain by residues 318–320. The closest structure found in a Dali search (30) was the penton protein of human adenovirus (31). The adenovirus penton structure has the same counterclockwise twist between the upper domain and lower domain as occurs in Sputnik. Like Sputnik, the upper domain of the adenovirus penton protein has the same fold as the upper domain of the Sputnik penton protein and is an insertion of 307 amino acids between β-strands D and E of the adenovirus lower domain. However, the adenovirus penton protein upper domain has an additional insertion of 53 amino acids between β-strands G and F. The adenovirus upper domain of the penton protein contains an Arg-Gly-Asp sequence that binds to the cellular αvβ3 receptor (32, 33). Only the nonenveloped viruses adenovirus and Sputnik have an insertion domain in their penton proteins. Sputnik, unlike adenovirus, does not have an Arg-Gly-Asp sequence or a fiber and attachment protein emanating from the fivefold vertices.

Single jelly-roll structure of sputnik penton protein. (A) Ribbon diagram of the Sputnik penton protein. The jelly-roll domain is colored green, and the insertion domain is colored red. (B) Diagrammatic representation of the arrangement of β-strands in the penton protein and the residue numbers at the ends of the β-strands.

Capsomer Interactions.

Any pseudohexameric capsomer formed by three double jelly-roll monomers has six edges (Fig. 5A). Each double jelly-roll monomer within a capsomer contributes to two edges, with each edge having an interaction with a neighboring capsomer. The interaction between neighboring capsomers can be divided into three classes. The first two classes form a pseudo-twofold axis between the first (f) edge of one capsomer (dominated by the CHEF sheet of the first jelly-roll) and the first (f) edge of a neighboring capsomer (ff), or between the second (s) edge of a capsomer (dominated by the CHEF sheet of the second jelly-roll) with the second (s) edge of another capsomer (ss). A third class of interaction (fs) is between the first (f) edge of one capsomer and the second (s) edge of a neighboring capsomer. This classification has similarities to that used to describe contacts between capsomers of PRD1 (34).

Asymmetric unit of Sputnik. (A) Capsomers are identified by Roman numerals I to V. Thirteen independent monomers are identified by Arabic numerals 1 to 13. Each MCP is shown by a green line (the first jelly-roll domain) followed by a blue line (the second jelly-roll domain). The independent minor proteins in the asymmetric unit are colored red. Icosahedrally related positions are indicated in the same manner but with corresponding faded colors. (B) The backbone of the MCP was colored according to the root mean square deviation of each Cα position from the mean of the superimposed 13 independent MCPs, ranging from blue (<0.6 Å) to red (>0.6 Å). (C) Number of times a given residue in the 13 independent MCPs is involved in capsomer to capsomer contacts ranging from blue (<8) to red (>8).

Each type of capsomer in one icosahedral asymmetric unit of Sputnik was identified by the Roman numerals I, II, III, IV, and V and the MCP monomers by Arabic numerals 1 to 13 (Fig. 5A). The rotational relationships between neighboring capsomers (Table S1) can be divided into a bend and twist component. The curvature of the viral capsid is determined by the bend angle. If all of the bend angles between neighboring capsomers were zero, then the capsomers would form a plane. The variation of bend angle was found to be limited to approximately 10°, 20°, and 40° degrees in the fs, ff, and ss classes, respectively.

Hydrogen bonds between capsomers were identified by visual inspection. The three classes of interactions, ff, ss and fs, could be subdivided into two or three subclasses depending on the conservation of hydrogen bonds (Table S1). Although there are five examples of class fs in the Sputnik structure, only three of these contact regions are associated with density probably representing the binding site of a minor capsid protein (see above). These three contact regions all belong to the same subclass fs-1, whereas the other two examples of fs contacts are associated with a different set of hydrogen bonds.

The root mean square deviation between equivalence Cα atoms is less than 0.43 Å on superimposing any pair of the 13 MCP structures on each other. However, there are specific regions where the MCP structure has greater variability (Fig. 5B), with displacements of the Cα atoms as much as 3.5 Å. These regions are mostly the loops at the top of each “tower” and in the CHEF β-sheets of the second jelly roll that make contacts with neighboring capsomers (Fig. 5C).

Empty Virus.

During the purification procedure of Sputnik (Bahan dan Kaedah), the virus separated into two bands while sedimenting through a cesium chloride gradient. The two bands corresponded to the full and empty virus. Subsequent work showed that empty particles can be produced from full particles either by raising the pH to 9 or lowering the pH to 5.5. It is therefore possible that the purified empty Sputnik particles were produced in a low-pH virus factory (35) during Mimivirus production. The purified empty particles were used in the reconstruction of a 3.8-Å resolution cryo-EM map (Bahan dan Kaedah and Fig. S5A). The empty Sputnik particles had a diameter that was approximately 5.2 Å larger than the diameter of the full infectious virus when measured along the threefold axes. However, there was no expansion along the fivefold axes. Presumably the expansion was made possible by the loss of interaction between the packaged DNA and the capsid structure.

The height of the penton density in the empty virus was approximately half of the hexon density, suggesting that some of the penton proteins were missing in the empty particles (Fig. 6A). Presumably the DNA had escaped from one of the vertices where there was no penton protein. Indeed, two particles that had been emptied by lowering the pH of the environment showed a feature that is probably DNA-like density spilling out from one of the vertices (Fig. S5B). A similar loss of the penton structure occurs for adenovirus, which can lose some pentons in the low-pH environment of an endosome (36). Similarly a mutant of the bacteriophage PRD1 can lose some pentons in the presence of a detergent, although PRD1, unlike Sputnik and Adenovirus, has a membrane (34). In the empty particle reconstruction of Sputnik, the electron density for residues 476–508 was missing in the MCP of monomer #1, the monomer adjacent to the penton (Fig. 6B). These residues are in the interface between the penton and hexon. However, it is not clear why these residues are completely disordered when only some of the pentons are missing, which would require disorder only in the #1 MCPs close to one of the missing penton sites. Thus, possibly the pH or other stress disorders these residues, resulting in only the loss of some pentons. The loss of pentons in double jelly-roll dsDNA viruses may be a general phenomenon for genome delivery.

Structure of the empty Sputnik. (A) Cross-section through the empty Sputnik cryo-EM map, showing where the density is at a higher level. The density of the penton protein is lower than that of the MCPs. (B) Electron density (red) of the hexon capsomer, adjacent to the penton protein in the empty virus (Meninggalkan) and full virus (Betul). The Cα backbone structure (green) of MCP #1, closest to the penton. The electron density from residue 476 to residue 508 of MCP #1 is missing in the empty virus. The Cα backbone structure of penton protein is colored blue.

Evolusi.

Single and double jelly-roll MCP structures have been observed in ssRNA, ssDNA, and dsDNA icosahedral viruses (19, 20, 34). In all these cases the jelly-roll is assembled into threefold symmetric capsomers that have quasi-sixfold symmetry. These capsomers are assembled into hexagonal arrays as predicted by Caspar and Klug (37), separated by approximately 75 Å center-to-center (19, 38). However, a double jelly-roll assembly is not feasible around the pentameric vertices. Hence, a single jelly-roll protein fold has been retained in all such viruses to complete the assembly around the pentameric vertices. For example, in picornaviruses the pentamer is formed by five copies of VP1 (13) in adenoviruses (39), PRD1 (40), PM2 (21, 22), and Sputnik the pentamer is formed by five copies of the penton molecule.

Many, but not all, dsDNA viruses that have a double jelly-roll capsid fold also have a lipid membrane envelope. Thus, the mode of genome delivery will be quite different for these viruses, even if the assembly process might be similar. Both Sputnik and adenovirus, neither of which have a membrane envelope, have a similarly structured inserted “upper” domain at the pentameric vertex that participates in viral entry for adenovirus (33, 41) and possibly therefore also in Sputnik. However, in contrast, PRD1 has a membrane and the penton is missing the “upper” insertion domain (22), suggesting a different genome delivery system.


Andrews, S. (2010). FastQC: A Quality Control Tool for High Throughput Sequence Data. Available online at: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/

Bellas, C. M., Anesio, A. M., and Barker, G. (2015). Analysis of virus genomes from glacial environments reveals novel virus groups with unusual host interactions. Depan. Mikrobiol. 6:656. doi: 10.3389/fmicb.2015.00656

Blanc, G., Gallot-Lavallພ, L., and Maumus, F. (2015). Provirophages in the Bigelowiella genome bear testimony to past encounters with giant viruses. Pro. Natl. Acad. Sains. U.S.A. 112, E5318�. doi: 10.1073/pnas.1506469112

Breitbart, M., and Rohwer, F. (2005). Here a virus, there a virus, everywhere the same virus? Trends Microbiol. 13, 278�. doi: 10.1016/j.tim.2005.04.003

Campos, R. K., Boratto, P. V., Assis, F. L., Aguiar, E. R., Silva, L. C., Albarnaz, J. D., et al. (2014). Samba virus: a novel mimivirus from a giant rain forest, the Brazilian Amazon. Virol. J. 11:95. doi: 10.1186/1743-422X-11-95

Darling, A. C., Mau, B., Blattner, F. R., and Perna, N. T. (2004). Mauve: multiple alignment of conserved genomic sequence with rearrangements. Genom Res. 14, 1394�. doi: 10.1101/gr.2289704

Desnues, C., La Scola, B., Yutin, N., Fournous, G., Robert, C., Azza, S., et al. (2012). Provirophages and transpovirons as the diverse mobilome of giant viruses. Pro. Natl. Acad. Sains. U.S.A. 109, 18078�. doi: 10.1073/pnas.1208835109

Edgar, R. C. (2004). MUSCLE: penjajaran urutan berganda dengan ketepatan tinggi dan hasil yang tinggi. Asid Nukleik Res. 32, 1792�. doi: 10.1093/nar/gkh340

Fischer, M. G., and Suttle, C. A. (2011). A virophage at the origin of large DNA transposons. Sains 332, 231�. doi: 10.1126/science.1199412

Gaia, M., Benamar, S., Boughalmi, M., Pagnier, I., Croce, O., Colson, P., et al. (2014). Zamilon, a novel virophage with Mimiviridae host specificity. PLOS SATU 9:e94923. doi: 10.1371/journal.pone.0094923

Guindon, S., Lethiec, F., Duroux, P., and Gascuel, O. (2005). PHYML Online𠄺 web server for fast maximum likelihood-based phylogenetic inference. Asid Nukleik Res. 33, W557–W559. doi: 10.1093/nar/gki352

Ignacio-Espinoza, J. C., Solonenko, S. A., and Sullivan, M. B. (2013). The global virome: not as big as we thought? Curr. Pendapat. Virol. 3, 566�. doi: 10.1016/j.coviro.2013.07.004

Jones, P., Binns, D., Chang, H. Y., Fraser, M., Li, W., McAnulla, C., et al. (2014). InterProScan 5: genome-scale protein function classification. Bioinformatik 30, 1236�. doi: 10.1093/bioinformatics/btu031

King, A. M., Adams, M. J., and Lefkowitz, E. J. (2011). Virus Taxonomy: Classification and Nomenclature of Viruses. Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, Elsevier.

Krupovic, M., Bamford, D. H., and Koonin, E. V. (2014). Conservation of major and minor jelly-roll capsid proteins in Polinton (Maverick) transposons suggests that they are bona fide viruses. Biol. Langsung 9:6. doi: 10.1186/1745-6150-9-6

Krupovic, M., and Koonin, E. V. (2015). Polintons: a hotbed of eukaryotic virus, transposon and plasmid evolution. Nat. Rev. Microbiol. 13, 105�. doi: 10.1038/nrmicro3389

Krupovic, M., Kuhn, J. H., and Fischer, M. G. (2016). A classification system for virophages and satellite viruses. Lengkungan. Virol. 161, 233�. doi: 10.1007/s00705-015-2622-9

La Scola, B., Desnues, C., Pagnier, I., Robert, C., Barrassi, L., Fournous, G., et al. (2008). The virophage as a unique parasite of the giant mimivirus. Alam semula jadi 455, 100�. doi: 10.1038/nature07218

Marchler-Bauer, A., Lu, S., Anderson, J. B., Chitsaz, F., Derbyshire, M. K., Deweese-Scott, C., et al. (2011). CDD: a Conserved Domain Database for the functional annotation of proteins. Asid Nukleik Res. 39, D225�. doi: 10.1093/nar/gkq1189

Patel, R. K., and Jain, M. (2012). NGS QC Toolkit: a toolkit for quality control of next generation sequencing data. PLOS SATU 7:e30619. doi: 10.1371/journal.pone.0030619

Roux, S., Tournayre, J., Mahul, A., Debroas, D., and Enault, F. (2014). Metavir 2: new tools for viral metagenome comparison and assembled virome analysis. BMC Bioinform. 15:76. doi: 10.1186/1471-2105-15-76

Yau, S., Lauro, F. M., DeMaere, M. Z., Brown, M. V., Thomas, T., Raftery, M. J., et al. (2011). Virophage control of antarctic algal host-virus dynamics. Pro. Natl. Acad. Sains. U.S.A. 108, 6163�. doi: 10.1073/pnas.1018221108

Yutin, N., Kapitonov, V. V., and Koonin, E. V. (2015). A new family of hybrid virophages from an animal gut metagenome. Biol. Direct. 10, 19. doi: 10.1186/s13062-015-0054-9

Zablocki, O., van Zyl, L., Adriaenssens, E. M., Rubagotti, E., Tuffin, M., Cary, S. C., et al. (2014). High-level diversity of tailed phages, eukaryote-associated viruses, and virophage-like elements in the metaviromes of antarctic soils. Permohonan Persekitaran. Mikrobiol. 80, 6888�. doi: 10.1128/AEM.01525-14

Zhang, Q., Ding, C., Achal, V., Shan, D., Zhou, Y., Xu, Y., et al. (2014). Potential for nutrient removal by integrated remediation methods in a eutrophicated artificial lake - a case study in Dishui Lake, Lingang New City, China. Water Sci. Technol. 70, 2031�. doi: 10.2166/wst.2014.453

Zhang, W., Zhou, J., Liu, T., Yu, Y., Pan, Y., Yan, S., et al. (2015). Four novel algal virus genomes discovered from Yellowstone Lake metagenomes. Sains. Rep. 5:15131. doi: 10.1038/srep15131

Zhou, J., Sun, D., Childers, A., McDermott, T. R., Wang, Y., and Liles, M. R. (2015). Three novel virophage genomes discovered from yellowstone lake metagenomes. J. Virol. 89, 1278�. doi: 10.1128/JVI.03039-14

Zhou, J., Zhang, W., Yan, S., Xiao, J., Zhang, Y., Li, B., et al. (2013). Diversity of virophages in metagenomic data sets. J. Virol. 87, 4225�. doi: 10.1128/JVI.03398-12

Keywords: virophage, genome, metagenomics, freshwater lake, diversity

Citation: Gong C, Zhang W, Zhou X, Wang H, Sun G, Xiao J, Pan Y, Yan S and Wang Y (2016) Novel Virophages Discovered in a Freshwater Lake in China. Depan. Mikrobiol. 7:5. doi: 10.3389/fmicb.2016.00005

Received: 02 November 2015 Accepted: 05 January 2016
Published: 22 January 2016.

Bernard La Scola, Aix Marseille Université, France

Christelle Desnues, URMITE Centre National de la Recherche Scientifique UMR 7278, France
Matthias Fischer, Max Planck Society, Germany

Copyright © 2016 Gong, Zhang, Zhou, Wang, Sun, Xiao, Pan, Yan and Wang. Ini adalah artikel akses terbuka yang diedarkan berdasarkan syarat-syarat Lesen Atribusi Creative Commons (CC BY). Penggunaan, pengedaran atau pengeluaran semula di forum lain dibenarkan, dengan syarat pengarang asal atau pemberi lesen dikreditkan dan bahawa penerbitan asal dalam jurnal ini dikutip, sesuai dengan amalan akademik yang diterima. Penggunaan, pengedaran atau pembiakan tidak dibenarkan yang tidak mematuhi syarat-syarat ini.


Tonton videonya: sandrinha fornalha no hotel baia cook experimentando biqwin3 #juazeiro #hotel (Januari 2022).