Maklumat

Thermosynechococcus elongatus - Biologi


Thermosynechococcus elongatus

Jentera tersembunyi gergasi fotosintetik terbongkar

Pencirian biokimia kompleks monomer PSI yang dimurnikan dari T. elongatus. Kredit: Biologi Komunikasi (2021). DOI: 10.1038 / s42003-021-01808-9

Fotosintesis adalah asas hampir semua hidupan di bumi, namun ia tidak difahami hingga perincian terakhir. Pasukan penyelidik antarabangsa kini telah membongkar salah satu rahsianya. Para penyelidik dari Ruhr-Universität Bochum (RUB), Universiti Osaka, Jepun, dan Universiti Kafrelsheikh, Mesir, berjaya mengasingkan manifestasi sistem fotos I yang jarang dan mempelajarinya secara terperinci. Kajian ini memberikan pandangan baru mengenai pengangkutan tenaga cahaya di kompleks protein fotosintetik gergasi ini. Karya kolaboratif diterbitkan dalam talian dalam jurnal Biologi Komunikasi pada 8 Mac 2021.

Kekuatan fotosintesis

Fotosintesis merupakan satu-satunya proses biologi, yang mengubah tenaga cahaya matahari menjadi tenaga tersimpan secara kimia. Pada tahap molekul, enzim kunci fotosintetik yang disebut fotosistem bertanggungjawab untuk proses penukaran ini. Photosystem I (PSI), salah satu dari dua sistem fotosistem, adalah kompleks protein membran besar yang dapat hadir dalam berbagai bentuk — seperti monomer, dimer, trimer atau bahkan tetramers.

Teknik pengasingan baru membantu mengungkap struktur PSI monomer

Walaupun struktur PSI trimerik dari termofilik cyanobacterium Thermosynechococcus elongatus dipecahkan 20 tahun yang lalu, masih belum dapat memperoleh struktur PSI monomerik yang sesuai. Kekacauan utama adalah kelimpahan semula jadi yang rendah dari bentuk PSI khusus ini. Oleh itu, kaedah pengekstrakan baru dikembangkan oleh para penyelidik di RUB, yang memungkinkan pengasingan selektif monomer PSI dengan hasil tinggi. Kompleks protein terpencil dicirikan secara terperinci di RUB dengan kaedah spektrometri massa, spektroskopi dan biokimia, sedangkan pasukan penyelidik di Universiti Osaka dapat menyelesaikan strukturnya dengan mikroskopi cryo-elektron.

Kerja berpasukan antara klorofil dan lipid memungkinkan pemindahan tenaga secara menaik

Struktur atom monomerik PSI memberikan pandangan baru mengenai pemindahan tenaga di dalam kompleks protein serta mengenai penyetempatan apa yang disebut klorofil merah - klorofil yang disusun khas, berinteraksi rapat antara satu sama lain dan dengan itu memungkinkan penyerapan tenaga rendah merah cahaya, yang biasanya tidak dapat digunakan untuk fotosintesis. Menariknya, struktur itu menunjukkan bahawa klorofil merah nampaknya berinteraksi dengan lipid membran sekitarnya. Susunan struktur ini mungkin menunjukkan bahawa tenaga haba tambahan digunakan untuk menjadikan cahaya merah jauh dapat diakses untuk fotosintesis.

Kerjasama jangka panjang membuahkan hasil

Penyelidikan kolektif dilakukan dalam rangka Program Promosi Penyelidikan Bersama Antarabangsa 824, perjanjian kerjasama antara Fakulti Biologi dan Bioteknologi di RUB dan Institut Penyelidikan Protein (IPR) di Universiti Osaka, yang ditubuhkan pada tahun 2017. Program Promosi selanjutnya menggabungkan kerjasama aktif dan jangka panjang antara Makmal Profesor Genji Kurisu di IPR dan kumpulan projek Bochum "Molekul Mekanisme Fotosintesis" yang diketuai oleh Profesor Marc Nowaczyk.

Program LabExchange yang baru ditubuhkan di Fakulti Biologi dan Bioteknologi dengan Universiti Osaka memberikan pelajar RUB kemungkinan tambahan untuk melaksanakan projek penyelidikan mereka di tanah terbit matahari.


Kinetik in vitro P 700 + pengurangan kompleks Thermosynechococcus elongatus trimeric Photosystem I oleh rekombinan sitokrom c 6 menggunakan spektrofotometer LED jenis Joliot

Kadar pengurangan Photosystem I (PSI) yang teroksidasi dengan pelbagai penderma elektron semula jadi dan buatan telah dipelajari dengan baik dengan spektroskopi penyerapan sementara. Kadar pemindahan elektron dari pelbagai penderma ke P700 + telah diukur untuk pelbagai organisma fotosintetik yang merangkumi sianobakteria, alga, dan tumbuhan. PSI boleh menjadi komponen yang membatasi kerana kaedah pengekstrakan dan pemurnian yang membosankan yang diperlukan untuk protein membran ini. Dalam laporan ini, kami telah menentukan in vivo, sitokrom intraselular c 6 (cyt c 6) / Nisbah PSI dalam Thermosynechococcus elongatus (T.e.) menggunakan analisis Western blot kuantitatif. Maklumat ini membenarkan penentuan P700 + kinetik pengurangan melalui cyt rekombinan 6 dalam nisbah yang relevan secara fisiologi (cyt c 6: PSI) dengan spektrofotometer pam-probe jenis Joliot, didorong oleh LED. Sampel PSI cair diuji di bawah pelbagai cyt c 6 kepekatan, suhu, pH, dan kekuatan ionik, masing-masing menunjukkan kecenderungan yang serupa dengan literatur yang dilaporkan menggunakan kepekatan PSI yang jauh lebih tinggi dengan spektrofotometer berasaskan laser. Walau bagaimanapun, hasil kami menunjukkan perbezaan kinetik antara sumber cahaya aktinik (laser berbanding LED), dan kami telah berusaha menyelesaikan kesan ini dengan mengubah intensiti dan tempoh cahaya LED kami. Konfigurasi standard spektrofotometer ini juga akan memungkinkan analisis kinetik sampel yang lebih seragam di makmal yang berbeza. Kami dapat menyimpulkan bahawa penemuan kami dari sistem berasaskan LED menunjukkan kesan kepekatan protein tambahan kerana banyak peristiwa pergantian P700 + pengurangan oleh cyt c 6 semasa rejim pencahayaan yang lebih lama.

Kata kunci: Cytochrome c 6 Pemindahan elektron Fotolisis kilat JTS-10 P700 Fotosistem I cyanobacteria termofilik.


Pandangan mengenai tingkah laku mengikat sitokrom asli dan bukan asli kepada sistem fotos I Thermosynechococcus elongatus

Pengikatan fotosistem I (PS I) dari Thermosynechococcus elongatus ke sitokrom asli (sit) c6 dan cyt c dari hati kuda (cyt cHH) dianalisis dengan pengukuran penggunaan oksigen, kalori titrasi isotermal (ITC), dan dok badan tegar yang digabungkan dengan pengiraan elektrostatik tenaga pengikat. Walaupun PS I mempunyai pertalian yang lebih tinggi untuk cyt cHH daripada cyt c6, pengaruh kekuatan ion dan pH pada pengikatan berbeza dalam kedua kes tersebut. ITC dan pengiraan teori mendedahkan adanya laman pengikatan yang tidak spesifik untuk cyt cHH selain satu laman web pengikatan khusus yang berdekatan dengan P700 Mengikat PS saya didapati sama untuk sit yang dikurangkan dan teroksidasi cHH Berdasarkan maklumat ini, keadaan yang sesuai untuk penghabluran sitrat cHH dengan PS I ditemui, menghasilkan kristal dengan PS I: cyt cHH nisbah 1: 1. Struktur kristal pada resolusi 3.4-obtained diperoleh, tetapi cyt cHH tidak dapat dikenal pasti dalam peta ketumpatan elektron kerana laman pengikatan yang tidak spesifik dan / atau fleksibiliti yang tinggi di laman pengikat tertentu. Memodelkan pengikatan sit c6 ke PS saya mendedahkan laman web pengikat khusus di mana jarak dan orientasi cyt c6 relatif kepada P700 setanding dengan cyt c2 dari bakteria ungu berbanding dengan P870 Karya ini memberikan pandangan baru mengenai kaedah mengikat sitokrom yang berbeza dengan PS I, sehingga memudahkan langkah-langkah untuk menyelesaikan PS I-cyt c struktur kos dan pemahaman yang lebih terperinci mengenai proses pengangkutan elektron semula jadi.

Kata kunci: kristalografi kompleks sitokrom c dok fotosintesis fotosistem I.

Penyataan konflik kepentingan

Penulis menyatakan bahawa mereka tidak mempunyai konflik kepentingan dengan isi artikel ini


Pengklonan, Pelarutan, dan Karakterisasi Sintesis Squalene dari Thermosynechococcus elongatus BP-1

RAJAH. 1. Penukaran FPP ke SQ. RAJAH. 2. Penjajaran urutan asid amino untuk SQS dari Rattus norvegicus (rSQS), Homo sapiens (hSQS), S. cerevisiae (ySQS), Arabidopsis thaliana (pSQS), Z. mobilis (zSQS), B. japonicum (bSQS), dan T. elongatus BP-1 (tSQS). Algoritma ClustalW digunakan untuk menghasilkan penjajaran (www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html). Tanda sempang menunjukkan jurang yang diperkenalkan untuk memaksimumkan penjajaran. Kawasan terpelihara I, II, III, dan IV ditunjukkan di atas urutan. RAJAH. 3. Pencirian penggabungan semula T. elongatus BP-1 SQS. (A) SDS-PAGE sampel dari pemurnian rekombinan T. elongatus BP-1 SQS. Lorong A, jalur penanda berat molekul B, ekstrak sel dari jalur ptBP1QXRO C, jalur aliran D, pecahan dicuci dengan jalur penimbal imidazol 50 mM E, pecahan dicuci dengan jalur penimbal imidazol 70 mM F, SQS yang dielusi dengan penimbal imidazol 250 mM . (B dan C) Autoradiogram plat TLC produk dari rekombinan T. elongatus BP-1 SQS. Pada panel B, plat TLC dikembangkan dengan 30 -70: 13: 8 kloroform-asid asid-piridin-air. Pada panel C, pengembangan dilakukan dengan heksana-toluena 4: 1. Lorong 1, [14 C] IPP. Jalur lain adalah seperti berikut: [14 C] IPP dan GPP dengan rekombinan E coli FPP synthase (lorong 2), dengan T. elongatus BP-1 SQS di hadapan NADPH (lorong 3), dan dengan T. elongatus BP-1 SQS tanpa adanya NADPH (lorong 4). Kedudukan [14 C] IPP, [14 C] FPP, [14 C] PSPP, [14 C] SQ, dan asal kromatografi (OR) ditunjukkan. RAJAH. 4. Ketergantungan aktiviti SQS dari T. elongatus BP-1 pada MgCl2 (A), pH (B), suhu (C), dan Tween 80 (D).

Abstrak

Pada spesies hijau, sukrosa dapat membantu mengatasi tekanan abiotik. Sucrose phosphate synthase (SPS) adalah enzim pembatas kadar yang terkenal dalam sintesis sukrosa. Namun, setakat ini, tidak ada struktur kristal SPS yang diketahui dari tumbuhan atau cyanobacteria. Dalam kajian ini, kami melaporkan struktur kristal SPS pertama dari Thermosynechococcus elongatus dengan UDP dan sukrosa-6-fosfat (S6P). Di dalam laman pemangkin, rantai sisi His158 dan Glu331, bersama dengan dua kumpulan fosfat dari UDP, membentuk ikatan hidrogen dengan empat kumpulan hidroksil bahagian glukosa dalam S6P. Perkaitan ini menyebabkan keempat-empat kumpulan hidroksil ini menjadi muatan negatif sebahagiannya, sehingga mendorong pembentukan ion oksokarbenium C1. Pecahan ikatan hidrogen antara His158 dan salah satu kumpulan hidroksil boleh mencetuskan pembentukan ikatan kovalen antara ion C1 oxocarbenium dan hidroksil C2 fruktosa-6-fosfat. Selaras dengan model struktur kami, kami melihat bahawa dua mutan SPS, H158A dan E331A, kehilangan semua aktiviti pemangkin. Lebih-lebih lagi, ketumpatan elektron residu dari dua gelung (loop1 dan loop2) dalam domain SPS A tidak diperhatikan, menunjukkan sifat dinamiknya. Analisis faktor-B dan rangsangan dinamik molekul enzim panjang penuh dan domain-A menunjukkan bahawa kedua-dua gelung sangat penting untuk mengikat dan melepaskan substrat dan produk. Di samping itu, analisis kecerunan suhu menunjukkan bahawa SPS menunjukkan aktiviti tertinggi pada 70 ° C, menunjukkan bahawa enzim ini berpotensi digunakan dalam pengeluaran industri S6P.


Perbincangan

Dalam kajian ini, kami mengenal pasti TeSPS (Uniprot code: tll1590) dari T. elongatus dan menunjukkan bahawa enzim aktif secara biologi. TeSPS berfungsi pada suhu yang lebih tinggi, menunjukkan aktiviti terbesarnya pada suhu 70 & # x00B0C. Struktur kristal bersama TeSPS yang dikomplekskan dengan UDP dan S6P menunjukkan bahawa enzimnya sangat padat, kemungkinan menjelaskan ketahanannya terhadap pembongkaran / penurunan pada suhu yang lebih tinggi (Berezovsky dan Shakhnovich, 2005). TeSPS mempunyai 8 residu Trp, 18 Tyr dan 14 Phe, berbeza dengan An-SPS-A dari Anabaena sp. PCC 7120 yang hanya berfungsi pada suhu normal, fisiologi. An-SPS-A mempunyai identiti 54% kepada TeSPS, tetapi hanya mempunyai residu 5 Trp, 14 Tyr dan 15 Phe, dengan jumlah residu teras hidrofobik yang lebih rendah. Dalam TeSPS, bilangan residu hidrofobik yang lebih tinggi berkemungkinan menyumbang untuk menstabilkan strukturnya dan menjadikannya lebih tahan terhadap denaturasi terma (Taylor dan Vaisman, 2010 Tsukamoto et al., 2016).

Pada tanaman, jalur sintesis sukrosa telah dikenal selama bertahun-tahun (Winter dan Huber, 2000). Walau bagaimanapun, hanya struktur SPS dari Halothermothrix orenii telah dilaporkan. Kekurangan struktur SPS lain mungkin disebabkan oleh bentuk dumbbellnya yang agak fleksibel yang dapat menghalang penghablurannya. Untuk mengkristalkan TeSPS, kami menggunakan ligannya UDP dan S6P untuk menstabilkan struktur protein dan menyelesaikan struktur kristalnya ke resolusi pada 3 & # x00C5. Kerana TeSPS berasal dari cyanobacteria, ia sangat berkaitan dengan SPS tumbuhan dan dapat digunakan sebagai model untuk memahami fungsi SPS tumbuhan.

Thermosynechococcus elongatus SPS mempunyai 452 residu, menjadikannya lebih pendek daripada SPS tanaman yang memiliki domain N-terminal tambahan. Oleh itu, TeSPS tidak boleh difosforilasi seperti SPS tumbuhan yang memungkinkannya diatur oleh irama diurnal. Selain itu, tahap ekspresi SPS tumbuhan juga dapat mengatur kegiatannya. Begitu juga, kemungkinan itu T. elongatus juga dapat mengawal aktiviti TeSPS dengan mengatur ekspresi dan / atau penurunannya. Walau bagaimanapun, mekanisme yang tepat memerlukan penjelasan.

Thermosynechococcus elongatus SPS adalah sejenis sintase sukrosa-fosfat (EC 2.4.1.14). Berdasarkan pengkelasan pangkalan data The Carbohydrate-Active EnZymes (CAZy) 4, TeSPS tergolong dalam keluarga glycosyltransferase 4 dan mempunyai motif glycogen phosphorylase GT (GPGTP) yang dipelihara (Wrabl dan Grishin, 2001). Hampir semua glikosiltransferase yang diketahui mempunyai motif ini yang dibentuk terutamanya oleh heliks 4 dan gelung yang menghubungkan heliks 4 dan helai 4, masing-masing disebut sebagai kedudukan 1 dan 2 (Wrabl dan Grishin, 2001). GPGTP ini telah dicadangkan untuk menjadi penting untuk mengekalkan aktiviti glikosiltransferase. Oleh itu, TeSPS pada dasarnya adalah glikosiltransferase yang tidak mengubah konfigurasi karbon anomerik glukosa semasa pemangkinan.

Kajian kecepatan tindak balas awal MshA menunjukkan mekanisme berurutan, dengan UDP-GlcNAc hampir pasti mengikat pertama diikuti dengan pengikatan 1-L-myo-inositol-1-fosfat (Vetting et al., 2008). Struktur kristal dan rangsangan MD kami menunjukkan bahawa TeSPS juga mengikuti mekanisme berurutan. Sekiranya tidak mengikat UDP, gelung 1 tidak dapat dilihat secara kristalografi dalam struktur domain-A. Walau bagaimanapun, apabila UDP mengikat enzim panjang penuh, faktor B gelung 1 dikurangkan dan nilai RMSD gelung itu dalam rangsangan MD juga lebih rendah daripada enzim panjang penuh. Oleh itu, UDPG (atau UDP) pertama kali mengikat pada antara muka domain A- dan B dan mempromosikan pembentukan separa pusat pemangkin melalui mekanisme muat yang diinduksi. Oleh itu, residu asas di pintu pusat pemangkin (Rajah 7) menangkap kumpulan fosfat F6P, dan Ala48 dan Gln51 membentuk ikatan hidrogen dengan kumpulan hidroksil residu fruktosa F6P untuk menstabilkan pengikatan.

Pro332 terletak di & # x201Posisi 2 & # x201D motif TeGPS GPGTP. Dalam struktur kristal bersama TeSPS, & # x201Posisi 2 & # x201D membentuk gelung (gelung 5). Residu proline ini berinteraksi dengan cincin glukosa pirranosa melalui ikatan CH / & # x03C0 (Zondlo, 2013), yang menstabilkan pengikatan S6P ke enzim. Apabila UDPG mengikat ke laman pemangkin, Pro332 atau gelung memaksa residu glukosa UDPG ke dalam penyesuaian itu dan mendorong pembentukan keadaan peralihan ke produk. Walaupun Pro332 tidak dipelihara di antara glikosiltransferase yang diketahui (Wrabl dan Grishin, 2001), sisa-sisa lain dalam gelung itu juga mungkin memainkan peranan yang sama dengan prolin ini.

Residu asid asparat dan glutamat (Glu331 dalam TeSPS) sangat terpelihara dalam motif GPGTP 2 & # x201D GPGTP glikosiltransferase (Wrabl dan Grishin, 2001). Oleh itu, dalam kajian ini, kami mengubah Glu331 menjadi alanine dan memperoleh varian E331A. Mutasi ini sepenuhnya menghapuskan aktiviti pemangkin TeSPS, hasil yang selaras dengan kajian mengenai glikosiltransferase lain. Dalam Acetobacter xylinium mannosyltransferase AceA, mutasi Glu287 (dipelihara seperti Glu331 dalam TeSPS) pada & # x201Posisi 2 & # x201D dalam motif GPGTP juga menyebabkan enzim kehilangan aktiviti (Abdian et al., 2000). Di samping itu, mutasi Glu510 pada & # x201Posisi 2 & # x201D (E510A) dalam sintase glikogen otot manusia juga melumpuhkan enzim (Cid et al., 2000). Dalam struktur kristal bersama kami, Glu331 secara langsung berkoordinasi dengan kumpulan 3-OH dari bahagian glukosa S6P, menunjukkan bahawa koordinasi ini penting untuk pemangkinan.

Struktur kristal glikosiltransferase yang diketahui menunjukkan bahawa selalu ada residu histidin yang mengkoordinasikan 6-OH residu gula monomerik (Wrabl dan Grishin, 2001 Gibson et al., 2002 Buschiazzo et al., 2004 Chua et al., 2008). Laporan sebelumnya menunjukkan bahawa pengubahsuaian kimia residu histidin dari SPS tumbuhan menghilangkan aktiviti (Sinha et al., 1998), menunjukkan bahawa histidin yang dipelihara ini terlibat secara langsung dalam pemangkin. Di sini, kami mengubah histidin yang dipelihara (His158) ke alanin, dan menunjukkan bahawa H158A tidak mempunyai aktiviti pemangkin (Rajah 11C), menunjukkan bahawa ikatan hidrogen yang terbentuk antara His158 dan kumpulan 6-OH glukosa S6P penting untuk pemangkin. Selain kumpulan 3-OH dan 6-OH yang membentuk ikatan hidrogen dengan Glu331 dan His158, kumpulan glukosa 2-OH dan 4-OH membentuk ikatan hidrogen kuat dengan atom oksigen dari dua kumpulan fosfat (P1 dan P2) dari UDP, masing-masing, menunjukkan bahawa dua kumpulan fosfat juga penting untuk pemangkinan. Ini seterusnya menunjukkan bahawa UDPG dapat membantu residu glukosa memasuki keadaan peralihan katalitik setelah diikat.

Seorang SNi (mekanisme pemangkin nukleofilik penggantian) seperti untuk Neisseria menignitidis glycosyltransferase telah dicadangkan berdasarkan struktur kristal bersama dengan analog substrat penerima dan penderma (Lee et al., 2011). Struktur kristal dua glikosiltransferase yang diketahui (OtsA dan MshA) dengan substrat menyokong mekanisme ini (Gibson et al., 2002 Buschiazzo et al., 2004). Di samping itu, hubungan tenaga bebas mengesahkan bahawa perencat OtsA adalah peniruan keadaan peralihan sinergis yang menyokong serangan nukleofilik depan-ke-muka yang melibatkan ikatan hidrogen antara kumpulan yang meninggalkan (penderma atau UDPG) dan nukleofil (akseptor atau G6P). Kesan isotop kinetik substrat penderma dan akseptor OtsA menunjukkan keadaan peralihan seperti ion oksokarbenium yang sangat disosiatif (Lee et al., 2011). Struktur kristal bersama TeSPS kami dengan UDP dan S6P selaras dengan S iniNi mekanisme pemangkin. Walau bagaimanapun, bagaimana ion oksokarbenium terbentuk tetap tidak jelas. Berdasarkan rangkaian ikatan hidrogen dengan residu glukosa S6P di pusat pemangkin TeSPS, kami mencadangkan model untuk menjelaskan penjanaan ion oksokarbenium dan pembentukan ikatan kovalen antara F6P dan residu glukosa ini (Rajah 12).

Gambar 12. Model pemangkin TeSPS. (A) Keadaan sebelum tindak balas ditunjukkan. (B) Residu glukosa UDPG membentuk ikatan hidrogen antara / antara kumpulan fosfat, His158, Glu331, dan F6P. Oleh kerana pembentukan ikatan hidrogen ini, cincin pyranose glukosa menjadi bermuatan negatif untuk mempromosikan C1 untuk membentuk ion oksokarbenium. (C) Ikatan hidrogen yang agak lemah yang terbentuk oleh His158 dan O6 terputus, yang menyebabkan cincin pirranosa kehilangan beberapa watak cas negatif dan memaksa ion oksokarbenium C1 membentuk ikatan kovalen dengan atom oksigen F6P. (D) UDP dan S6P dilepaskan dari pusat pemangkin.

Seperti yang dinyatakan sebelumnya, kumpulan hidroksil glukosa dikoordinasikan sepenuhnya, membentuk ikatan hidrogen dengan His158, Glu331, dan atom oksigen fosfat. Pembentukan ikatan hidrogen yang kuat ini menyebabkan atom oksigen dari kumpulan hidroksil menjadi sebahagian negatif. Cincin glukosa pirranosa mungkin berkongsi cas negatif sebahagiannya seperti ikatan peptida. Oleh kerana kesan ini, ikatan kovalen yang terbentuk antara UDP dan residu glukosa kemungkinan akan putus, sehingga memungkinkan ion oksokarbenium terbentuk. Ion oksokarbenium yang bermuatan positif dapat meneutralkan cas negatif sebahagian ini melalui kesan resonans di dalam cincin pirranosa. Pada langkah-langkah berikut, ion oksokarbenium, atom oksigen UDP, dan hidrogen F6P akan membentuk triad katalitik, seperti yang diusulkan oleh Seung et al. (Lee et al., 2011). Kami membuat hipotesis bahawa pemisahan ikatan hidrogen antara His158 dan kumpulan glukosa 6-OH mencetuskan pembentukan ikatan glikosidik antara F6P dan glukosa. Ikatan hidrogen yang dibentuk oleh His158 dan kumpulan 6-OH ini lebih lemah daripada ikatan hidrogen yang terbentuk antara Glu331 dan kumpulan fosfat dan hidroksil. Glu331 dan kumpulan fosfat ini dicas sepenuhnya negatif, sedangkan His158 dapat memperoleh atau melepaskan elektron dengan mudah. Oleh itu, ikatan hidrogen yang terbentuk oleh sisa ini tidak akan stabil. Lebih-lebih lagi, kumpulan 6-OH berada di bahagian fleksibel cincin heksosa. Dalam banyak struktur kristal bersama protein terikat heksosa, kumpulan 6-OH sering tidak diperhatikan (Su et al., 2015 Si et al., 2016). Oleh itu, ikatan hidrogen antara His158 dan kumpulan 6-OH dapat diputuskan. Sekiranya ini berlaku, maka cincin pirranosa akan mempunyai muatan negatif yang kurang dan tidak dapat meneutralkan muatan positif pada ion oksokarbenium. Ini seterusnya akan memaksa ion oksokarbenium untuk mencari atom bermuatan negatif yang lain untuk membentuk ikatan kovalen. Pada ketika itu, atom hidrogen F6P pada dasarnya akan ditangkap oleh atom oksigen dari kumpulan fosfat UDP, dan ion oksokarbenium dapat dengan cepat membentuk ikatan kovalen baru dengan atom oksigen F6P. Secara keseluruhan, ini adalah turun naik cas pada His158 dan fleksibiliti kumpulan glukosa 6-OH yang mencetuskan pembentukan S6P.


Abstrak

Spektrum pendarfluor yang diselesaikan masa dari kompleks trimerik fotosistem I (PS-I) yang diasingkan dari cyanobacterium termofilik, Thermosynechococcus (T.) elongatus, diperhatikan pada suhu 15 K dalam jangka masa dari 100 fs hingga beberapa nanodetik dalam keadaan teroksidasi P700 dan 10 ps hingga beberapa nanodetik dalam keadaan berkurang P700. Analisis yang sesuai secara global terhadap data keadaan teroksidasi P700 mendedahkan adanya tiga klorofil merah berlainan kinetik (Chls) yang mempunyai masa pemindahan tenaga ke P700 + 6.1 ps (C6.1 ps), 140 ps (C140 ps), dan 360 ps (C360 ps). Mengikut bentuk spektrum DAS, C6.1 ps, C140 ps, dan C360 ps masing-masing ditugaskan untuk Chls merah yang dilaporkan dengan maksimum penyerapan pada 715 nm (C715), 710 nm (C710), dan 719 nm (C719), masing-masing. Dalam PS-I yang mengandungi P700 +, ca. 60 Chls menyalurkan tenaga pengujaan menjadi C6.1 ps dalam rantau waktu subpicosecond pada 15 K. Analisis data sekarang bersama dengan kesimpulan dari laporan sebelumnya menunjukkan bahawa dalam PS-I yang mengandungi P700 neutral, pemindahan tenaga langsung dari Chls pukal ke P700 nampaknya menguasai aliran tenaga proses. Simulasi masa pemindahan tenaga ke P700 + berdasarkan teori Förster mencadangkan dimensi Chls A32-B7 dan A33-A34 sebagai calon yang paling mungkin untuk C140 ps (C710) dan C360 ps (C719), masing-masing. C6.1 ps (C715) ditugaskan sementara untuk dimensi Chl B24-B25 atau A26-A27, yang mana pemindahan tenaga terpantas ke P700 + diramalkan dari simulasi. Walau bagaimanapun, anggaran masa pemindahan tenaga ke P700 + untuk Chls dimerik ini adalah 44−46 ps, yang masih jauh lebih perlahan daripada nilai yang diperhatikan 6.1 ps. Kerangka teori di luar teori Förster standard mungkin diperlukan untuk menjelaskan penyimpangan yang teruk.


Abstrak

Peta ketumpatan elektron kristal 3D Photosystem II dari Thermosynechococcus vulcanus dengan pameran beresolusi 1.9 PD (PDB: 3ARC), dalam dua monomer dalam sel unit asimetri, sehingga, sekarang, perbezaan kuat yang tidak dikenal pasti dan tidak ditafsirkan dalam ketumpatan elektron berpusat pada jarak sekitar 1.5 Å dari nitrogen Nδ dari imidazol cincin D2-His336. Oleh MALDI-TOF / MS setelah pencernaan triptik, ditunjukkan bahawa ∼20-30% serpihan yang mengandungi residu D2-His336 dari Photosystem II dari kedua-duanya Thermosynechococcus vulcanus dan Thermosynechococcus elongatus menanggung jisim tambahan +16 Da. Jisim tambahan seperti itu mungkin sepadan dengan pengubahsuaian histidin pasca terjemahan atau hidroksil kimia yang belum pernah terjadi sebelumnya.


Teknik mikrokristalisasi untuk kristalografi femtosecond bersiri menggunakan sistem fotos II dari Thermosynechococcus elongatus sebagai sistem model

Kristalografi femtosecond bersiri (SFX) adalah kaedah baru yang muncul, di mana data difraksi sinar-X dikumpulkan dari aliran biomolekul nano atau mikrokristal sepenuhnya yang terhidrat dalam minuman keras induknya menggunakan laser elektron bebas sinar-X bertenaga tinggi. Kejayaan eksperimen SFX sangat bergantung pada kemampuan menumbuhkan sejumlah besar nano / mikrokristal yang tersusun dengan baik untuk pengagihan saiz homogen. Walaupun kaedah untuk menumbuhkan kristal tunggal besar telah banyak diterokai pada masa lalu, pengembangan kaedah untuk menanam nano / mikrokristal dalam jumlah yang mencukupi untuk eksperimen SFX masih di peringkat awal. Di sini, kami menerangkan dan membandingkan tiga kaedah (kumpulan, penyebaran antara muka bebas (FID) dan sentrifugasi FID) untuk pertumbuhan nano / mikrokristal untuk eksperimen SFX yang diselesaikan masa menggunakan fotosistem II kompleks protein membran besar sebagai sistem model.

1. Pengenalan

Kristalografi sinar-X adalah teknik yang paling produktif untuk menyelesaikan struktur protein dalam biologi struktur. Penentuan struktur protein larut telah mencapai kemajuan besar dalam beberapa tahun kebelakangan ini, dengan lebih daripada 99 000 struktur dipecahkan. Walau bagaimanapun, penentuan struktur protein yang sukar dikristalisasi, seperti kompleks multi-protein dan protein membran, sangat ketinggalan, dengan kurang daripada 400 struktur protein membran unik yang ditentukan setakat ini [1]. Salah satu langkah pembatasan kadar untuk penentuan struktur protein membran dengan kaedah kristalografi standard adalah pertumbuhan kristal tunggal yang besar dan teratur. Penentuan struktur protein membran yang dipecahkan hingga kini sering memerlukan proses yang panjang yang memakan masa bertahun-tahun (atau kadang-kadang bahkan beberapa dekad) untuk tumbuh kristal yang besar dan tersusun yang sesuai untuk penentuan struktur sinar-X. Kerosakan sinar-X adalah masalah utama dalam kristalografi sinar-X standard untuk banyak kristal protein [2], terutamanya apabila ia mengandungi kofaktor aktif redoks [3], oleh itu mengenakan batasan untuk difraksi sinar-X pada mikrokristal, walaupun dalam keadaan kriogenik [4].

Kaedah baru kristalografi femtosecond bersiri (SFX), mengatasi banyak batasan kristalografi sinar-X konvensional, sehingga membuka jalan baru yang menarik untuk kristalografi protein membran [5-7]. Adalah luar biasa bahawa bukti prinsip pertama untuk SFX dilakukan bukan dengan lisozim atau protein kecil yang mudah dikristalisasi tetapi dengan fotosistem I (PSI), yang terdiri daripada 36 protein yang 381 kofaktor tidak terikat secara kovalen [5 ]. Di SFX, puluhan ribu corak difraksi dapat dikumpulkan dalam beberapa minit pada nano- dan mikrokristal terhidrat sepenuhnya dalam minuman keras ibu mereka, pada suhu bilik. Denyutan sinar-X laser sangat pendek sehingga mereka 'mengatasi' kerosakan sinar-X oleh prinsip difraktkan sebelum hancur [8] yang juga membuka jalan baru untuk kristalografi yang diselesaikan masa [9,10]. Tidak seperti kristalografi tradisional, teknik SFX memberikan ribuan kristal kecil berukuran mikrometer dalam aliran cecair ke denyutan sinar-X femtosecond, menggunakan laser elektron bebas sinar-X (XFEL). Teknik ini menguntungkan kerana kristal yang lebih kecil mempunyai gangguan jarak jauh yang lebih rendah dibandingkan dengan kristal yang lebih besar dan kristal yang lebih kecil dapat tumbuh dengan lebih mudah. Penurunan gangguan jarak jauh pada nanokristal sangat menguntungkan bagi kristal protein membran dan kompleks protein besar, yang selalunya paling sukar untuk mengkristal. Kristal ini sering terganggu oleh gangguan jarak jauh dan resolusi anisotropik yang membawa kepada mosaik yang tinggi. Sebelum SFX, pertumbuhan kristal kecil tidak diinginkan, menjadikan pertumbuhan dan penciriannya relatif tidak dapat diterokai. Kajian pertama kristal yang ditanam khusus untuk SFX menerangkan pertumbuhan PSI nano dan mikrokristal. Dalam kajian ini, kristal ditumbuhkan oleh ultrafiltrasi pada kekuatan ion rendah. Dalam kaedah ultrafiltrasi, larutan protein dibawa ke zon nukleasi dengan perlahan-lahan memusatkan protein pada kekuatan ion rendah. Kaedah ini juga dapat digunakan untuk penghabluran protein pada kekuatan ion tinggi atau menggunakan pemendapan lain yang melalui membran ultrafiltrasi (C. Kupitz et al. 2014, data yang tidak diterbitkan). Walau bagaimanapun, tidak sesuai untuk penghabluran protein membran apabila menggunakan polietilenaglikol (PEG) dengan berat molekul yang lebih tinggi, kerana PEG adalah polimer yang sangat fleksibel dan memanjang yang tidak mudah melalui membran ultrafiltrasi (bahkan PEG1000 (dengan jisim molekul relatif sahaja) 1 kDa) tidak melalui kuantitatif melalui membran ultrafiltrasi dengan cuff-off 1000 kDa). Sayangnya, PEG adalah salah satu pemendam yang paling sering digunakan dalam kristalografi, dan sebahagian besar protein membran, termasuk fotosistem II (PSII), [11–13] telah dikristal dalam kehadiran PEG. Karya ini menggunakan PSII, kompleks protein membran besar, untuk meneroka teknik untuk pertumbuhan dan pencirian nano / mikrokristal.

PSII adalah salah satu enzim terpenting dalam proses fotosintesis, mengubah tenaga cahaya dari matahari menjadi tenaga kimia. Ia memangkin pemindahan elektron transmembran yang dipancarkan cahaya dari air, yang berfungsi sebagai sumber elektron, ke plastoquinone. Reaksi pengoksidaan air melibatkan empat peristiwa pemisahan cas, di mana dua molekul air dioksidakan, yang membawa kepada penjanaan empat proton, empat elektron dan satu molekul oksigen (untuk tinjauan mengenai PSII lihat [14]). Reaksi ini bersifat unik, di mana PSII telah menghasilkan semua oksigen di atmosfera dan mengubah planet kita dari anoxygenic menjadi atmosfer oksigen 2.5 bilion tahun yang lalu. Reaksi ini menjadikan PSII sebagai calon tenaga yang boleh diperbaharui dan oleh itu memahami struktur dan fungsinya sangat penting [15,16]. Walau bagaimanapun, PSII adalah protein yang sangat sukar untuk berfungsi. Hasil kerja struktur masa kami yang diselesaikan pada PSII, yang dibentangkan di Royal Society Workshop, diterbitkan di tempat lain [17]. Di sini, kami memberi tumpuan kepada pengembangan kaedah untuk pertumbuhan nano / mikrokristal, menggunakan PSII sebagai sistem model. Teknik yang disajikan akan memberi kesan luas pada projek-projek saat ini dan masa depan yang bertujuan untuk menentukan struktur dan dinamika biomolekul menggunakan SFX.

Kaedah SFX dan kejayaan eksperimen di XFEL bergantung pada pertumbuhan nano- atau mikrokristal berkualiti tinggi yang dihantar ke balok FEL dalam aliran cecair minuman keras ibu mereka. Sebilangan besar eksperimen SFX telah dilakukan menggunakan penyuntik dengan muncung dinamik gas maya [18,19], yang dipasang pada garis sinar pencitraan sinar-X (CXI) koheren di Sumber Cahaya Koheren Linac (LCLS) dan menyampaikan sampel dengan kadar aliran 10-20 μl min −1. Reka bentuk penyuntik alternatif, dengan kadar aliran yang lebih rendah juga dikembangkan, namun memerlukan protein dihantar dalam media yang sangat likat. Mereka termasuk penyuntik yang dijelaskan oleh Sierra et al. [20] yang memberikan protein dengan elektrospinning dan perkembangan terkini reka bentuk penyuntik baru yang membolehkan penghantaran kristal protein dalam fasa kubik lipid [21].

Untuk SFX pada kristal protein, sebilangan besar nano / mikrokristal bersaiz dan kualiti yang seragam diinginkan. Walaupun kaedah pengembangan pertumbuhan kristal untuk kristalografi sinar-X standard banyak difokuskan pada kaedah baru untuk meningkatkan ukuran dan kualiti kristal, kaedah untuk pertumbuhan nanokristal berkualiti tinggi sangat diinginkan, namun sebagian besar belum diterokai.

Kami menggunakan PSII sebagai kes ujian untuk membandingkan kaedah pertumbuhan nanokristal yang berbeza dan menunjukkan bagaimana alat diagnostik seperti penyerakan cahaya dinamik (DLS) dan pencitraan nonlinier kristal kiral (SONICC) [22] boleh digunakan sebagai alat diagnostik untuk mengoptimumkan pertumbuhan nanokristal untuk SFX.

2. Bahan dan kaedah

(a) Pertumbuhan sel dan pemurnian protein

Currently, the method of SFX uses a liquid injector that requires large amounts of protein. Typical SFX experiments are performed at a flow rate of 10–20 µl min −1 and microcrystal suspensions with 10 10 –10 11 crystals ml −1 , depending on the desired ‘hit rate’. The concentration of protein for collection of the SFX data thereby depends on the size distribution of the crystals, and for 1–5 µm crystals is commonly in the range 10–20 mg ml −1 [5,23,24]. Thereby the amount of protein required for SFX experiments is large and one 12 h experiment can easily require 50–100 mg of protein.

PSI and PSII were some of the first proteins used as model systems for SFX [5,25], and it is often assumed that they were chosen because they are abundant in nature, can be isolated in large amounts and are easy to isolate and crystallize. Unfortunately, these assumptions are wrong. The photosystems have been used as model systems because of their extreme importance for bioenergy conversion on the Earth, despite the fact that they are probably some of the most difficult proteins to work with. PSII is a large multiprotein cofactor complex, consisting of 19 proteins and more than 50 cofactors in Thermosynechococcus elongatus [26]. It undergoes constant remodelling in the native membrane due to photodamage [27]. In the native membrane, PSII has a half-life of 30 min, with between 30 and 70% being under reconstruction depending on the environmental conditions such as light, temperature, pH and cell density. It is therefore of extreme importance to grow the cells under reproducible conditions. We grow the cells of T. elongatus at 56°C in Casteholz medium in a custom-designed 122 l photobioreactor, shown in figure 1, which controls all important parameters. It increases the light intensity in parallel with the cell density and controls the pH by feeding an air/CO2 mixture into the system. The cells are grown in a continuous mode, therefore keeping them in the logarithmic growth phase 30 l of the cell culture is harvested each week, which corresponds to 22–28 g wet cell mass. Compared with cultures of Escherichia coli the yield of cells is low, with less than 1 g of cells harvested per litre of cell culture.

Figure 1. Photobioreactor developed for large-scale growth of photosynthetic algae and cyanobacteria. The reactor has a capacity of 122 l. It can be sterilized in situ and allows for control of light intensity, cell density, temperature, pH and gas flow.

The purification of PSII from the cells is performed in principle as described by Zouni et al. [11], which includes isolation of photosynthetic membranes by differential centrifugation, solubilization of PSII with the detergent beta-dodecylmaltoside and purification of PSII by ion-exchange chromatography. In our modification of the Zouni et al. protocol, cell disruption is performed using a microfluidizer, which breaks the cells rapidly by shear forces in a small capillary at 18 000 psi in the flow-through mode, where 80 g of cells on ice can be broken quantitatively in less than 2 min. Also, large-scale column purification is performed in a staggered mode to increase capacity. Immediately after column purification, three or four recrystallization steps (see §2b) are carried out to purify the protein further. The photobioreactor is operated in a continuous mode, where 30 l cell culture can be harvested weekly for preparation of PSII crystals, with 1.3–1.6 mg PSII being obtained from 1 l cell culture. This means that 10–20 protein preparations are required to produce sufficient amounts of PSII nanocrystals for five shifts of TR-SFX experiments.

(b) Crystallization as a last purification step

Only fully active dimeric PSII with intact subunit composition crystallizes, while PSII that is in the process of assembly/disassembly that is missing all or part of the lumenal extrinsic proteins PsbV, PsbU or PsbO does not crystallize. This occurs because PsbV is involved in crystal contacts therefore crystallization can be used as a last purification step (P. Fromme 2003, unpublished results). In this process, PSII is precipitated three times at a Chl concentration of 0.75 mM, with decreasing concentrations of precipitant buffer Dx (100 mM Pipes pH 7.0, 5 mM CaCl2, 5 mM MgCl2, X% PEG2000), X = 7.5%, 6.5% and 5.5%, respectively. The solubility decreases as homogeneity of the protein sample increases therefore, the PEG concentration is decreased in each of the recrystallization steps. The first and second precipitation/crystallization steps are allowed to progress for 1 h in complete darkness, on ice. The third precipitation is allowed to proceed for 8 h on ice under the same conditions.

(c) Comparison of different methods for the growth of nanocrystals

Three different techniques are compared to obtain microcrystals for SFX: the batch method, free interface diffusion (FID) and FID with centrifugation. All experiments are carried out at a chlorophyll concentration of 0.5 mM Chl at 10°C aiming for nanocrystal growth in 24–48 h.

(i) Batch method

To grow crystals in a batch experiment, the phase diagram should be known, to ensure that the solution is in the nucleation zone after mixing. The determination of the solubility curve can be quite time-consuming and is best performed by stepwise dissolution of crystals by lowering the precipitant concentration. This can be done either manually or by automated stepwise dilution of the precipitant solutions in the reservoirs. We determine the borderline between metastable and nucleation zone by small-scale batch experiments, where seeding crystals are added. In the nucleation zone, addition of seeding crystals leads to massive secondary nucleation. By contrast, the seed crystals added to the metastable zone grow without new crystals appearing. A schematic phase diagram indicating suitable starting points for batch crystallization experiments is shown in figure 2.

Figure 2. Schematic phase diagram with suitable starting points for batch experiments. All batch experiments should ideally start in the nucleation zone. The nucleation rate increases with the increase of supersaturation, leading to a larger amount of crystals.

Once the phase diagram has been determined, the batch experiments are performed by simple rapid mixing of the protein with the precipitation buffer, under conditions where the solution will be in the nucleation zone after mixing. Then batch crystallization is routinely tested at five different protein concentrations combined with a fine screening of precipitant concentration. This is performed in small scale before the complete protein sample is crystallized in a large batch. The result of such a batch experiment with PSII is shown in figure 3.

Figure 3. Batch method experiment performed using 0.5 mM Chl, and 13% PEG2000 as starting conditions. (a,b) Images of crystals created using the batch method. There are numerous large crystals, and these are obviously polycrystalline. (c) SONICC image of the entire drop of (b) confirming crystallinity. (d) DLS histogram showing that the majority of the crystals are around 10 μm radius.

Seeding is regularly used for growth of large, single crystals but is also extremely helpful for growth of nanocrystals in batch. Addition of small nanocrystals (best less than 500 nm) to the precipitant solution prior to mixing of precipitant and protein, leads to a massive increase in the nucleation rate. It also can overcome a serious problem that is observed for nanocrystal growth where proteins do not spontaneously crystallize but crystals grow out of an amorphous precipitate in the time frame of weeks. This crystallization condition is the worst-case scenario for nanocrystal growth, but can be partially overcome by adding seeds to the precipitate. The question could now be asked, how can seeds be formed when only larger crystals have been obtained? In this case, one can break the large crystals and use them as crude seeds in step 1 of the experiment. Once these large seeds induce nucleation, nice nano- and microcrystals appear in large showers which can then be used in the next step as seeds. While all these methods help to grow nano- and microcrystals for SFX in batch, the size distribution achieved is often very broad and varies between individual experiments. Furthermore, crystal growth is also very fast, so nice small crystals can grow in a few minutes into larger crystals with visible defects.

Crystal growth can progress rapidly, so crystal growth must be monitored by DLS in short time intervals to stop crystal growth at the desired size by rapid dilution in high precipitant buffer. Unfortunately, the crystals of PSII formed by the batch crystallization method tend to be polycrystalline, resembling starfish. DLS showed that the predominant size of the crystals was 5–20 µm, but optical inspection showed large crystals up to 300 µm in size, though these large crystals can be removed from the solution by prefiltering and in-line filtration. SFX data can be collected on these 5–20 μm crystals even if they are starfish shaped. Most of the diffraction patterns are single crystal diffraction patterns because in most cases the small X-ray focus of only 1 µm ‘hits’ only one of the ‘lobes’ of the starfish-shaped crystal. However, crystals of this size (even if they are perfectly shaped) are not suitable for time-resolved (TR)-SFX as data collection and evaluation face multiple problems: higher mosaicity of the crystals due to their larger size, non-uniform light excitation of PSII in the crystals due to absorption of the photons within the crystal, extremely low hit rates, high sample consumption and fluctuations in the liquid jet position. The jet is only 4 µm in diameter if the size of the crystals exceeds the size of the jet, the jet becomes unstable and wiggles or even ‘jumps’ when a large crystal exits the nozzle. This further decreases the hit rate as the FEL X-ray beam may not ‘hit’ the jet when it moves. Furthermore, a kinked or wiggling jet path can lead to deposition of materials on the walls of the shroud. This material accumulates at the walls of the injector forming stalagmites of the precipitants (here PEG, salts and buffer) that slowly grow into the interaction region, whereupon data collection has to be stopped and the chamber has to be evacuated and cleaned.

(ii) Free interface diffusion

In this method, crystals are grown at the interface between a highly concentrated protein solution and the precipitant solution. It was designed to grow small, well-ordered crystals to overcome the problems described above for SFX data collection on 5–20 µm crystals.

FID is used in standard crystallography to create a continuous concentration gradient leading to growth of crystals of increasing sizes along a concentration gradient. Its most common use is in Granada crystallization box experiments. Recently, microfluidic devices have been developed to use FID for mapping the phase diagram and optimization of nanocrystal growth [28] however, they have not yet reached the capacity for large-scale growth of 50–100 mg of PSII nanocrystals for TR-SFX studies. The standard methods of FID used in traditional crystallography, where large crystals are desired, use small capillaries for the crystallization experiments to minimize the size of the interface region and create a smooth linear concentration gradient. Using this set-up, one can achieve nanocrystal growth at the interface, but the crystal size increases along the concentration gradient which leads to a very low yield of nanocrystals. Furthermore, it would be painstaking to accumulate 10 ml of nanocrystal suspension by harvesting nanocrystals from the interface of hundreds of small capillaries. To maximize the surface/volume ratio, we experimented with several different set-ups and geometries, but the best result came from the simplest method, performing the crystallization experiments in 1.5 ml reaction vessels. For the initial screening of conditions, we use volumes of 20 µl protein and 20 µl precipitant solution, which can be scaled up to 500 µl plus 500 µl. In the first sets of experiments, we tried to form a ‘perfect’ free interface by layering the protein solution (which has a lower density than the precipitate) very carefully on top of the precipitant (figure 4a). While nanocrystals formed at the interface, the yield was low and these crystals quickly grew into larger starfish-like crystals similar to what is shown for the batch experiments in figure 3.

Figure 4. Schematic of the set-up for crystallization experiments with FID (a,b) and FID centrifugation (c). (a) Experimental set-up in which the protein solution is carefully layered on top of the precipitant solution, where only few crystals form at the interface. (b) In the inverse set-up the precipitant solution is added dropwise to the protein solution, inducing increased transient nucleation at the drop–protein interface. (c) The experiment shown in (b) is continued by centrifugation. The nuclei formed in the protein solution are accelerated by centrifugation towards the interface zone, where they grow into nano- or microcrystals. When they reach a specific size they sediment into the precipitant zone, where they stop growing. Thereby nano- or microcrystals with a very narrow size distribution can be achieved.

The nucleation rate was dramatically increased by the inversion of the set-up, shown in figure 4b. Here, the protein is pipetted into the bottom of the reaction vessel. This is followed by slowly dropping the precipitant solution through the protein layer at a rate of roughly 20 μl min −1 . This procedure causes a large transient interface area where the small drops of the precipitant move through the protein to form two layers. Eventually, the two phase system forms with the precipitant solution forming a dense bottom layer with the protein on top.

The results of one of these experiments are shown in figure 5 and reveal that the crystals are significantly smaller, with an average radius of 1–2 μm. The crystals also display much less polycrystallinity, with most of the crystals being single.

Figure 5. FID experiment using 0.5 mM Chl and 13% PEG2000 as starting conditions. (a,b) Images of crystals created using the FID method, showing that crystals are significantly smaller and more uniform in size. (c) SONICC image of the drop of (a) confirming crystallinity. (d) DLS histogram indicating that the majority of the crystals are of 2–5 μm radius.

(iii) Free interface diffusion centrifugation

This third method represents a further modification of the FID method, where the formation of the two-phase system is followed by centrifugation. A schematic drawing of the process is shown in figure 4c. Here, the reaction vessel is centrifuged after the interface has been formed, at a slow speed of 200–500 g using a swinging bucket or a fixed angle centrifuge. The centrifugation has two positive effects that support the formation of well-ordered nanocrystals: (i) the nanocrystals start sedimenting into the precipitant when they have reached a specific size. As there is no protein present in the precipitant solution, the growth of the crystals stops as soon as they enter the precipitant layer. Thereby a very uniform size distribution of small nanocrystals is achieved. (ii) Small nuclei, which form in the protein solution by diffusion of the precipitant into the protein layer, are accelerated towards the interface where the increased precipitant concentration allows them to grow into stable nanocrystals, which then enter the precipitant zone where crystal growth stops. Thereby a constant ‘stream’ of newly formed nuclei enters the interface zone and continues to grow into nanocrystals until they enter the precipitant zone. The process is fast at first and then slows down as the concentration of the protein decreases below the nucleation line. This process takes place in a time frame of 30 min to 24 h, with the majority of the crystals forming after 30 min. The crystals have a very uniform size distribution. Figure 3 shows a typical experiment where most of the crystals have a radius of 500 nm. The initial screening of conditions can be performed with the same volumes as described for the FID experiments (20 µl protein plus 20 µl precipitant). The best conditions are those scaled up to a volume ratio of 50 µl protein plus 50 µl precipitant). The results obtained with this volume ratio scale up very reproducibly to experiments at the optimal volume ratio of 1∶1. We have also twice scaled the crystallization experiments up to volumes of 6 ml protein plus 6 ml precipitant, where the experiment is performed in 15 ml Falcon tubes.

We have tested several parameters that affect the growth of the crystals by the FID centrifugation method. The size of the crystals depends on the protein concentration and precipitant concentration, and is also influenced by the viscosity of the precipitant solution. The speed of centrifugation does not have a large effect on crystal size and yield within the tested range 200–500 g. The yield increases strongly with crystallization time between 5 and 30 min. The crystal yield is only slightly increased when centrifugation is continued to up to 24 h. Crystals of uniform size can be harvested after only 30 min. The size of the crystals grown with this technique can be varied by adjusting protein and precipitant concentration, but crystals grown with this method are consistently below 2 μm radius see figure 6 for examples.

Figure 6. Free interface diffusion centrifugation experiment using 0.5 mM Chl and 13% PEG2000 as starting conditions. (a,b) Images of crystals showing that they are smaller and very uniform in size they grow in approximately 30 min. (c) SONICC image of the entire drop of (b) confirming crystallinity. (d) DLS histogram showing that the majority of the crystals are around 500 nm radius.

(d) Quenching of crystal growth

Ideally, crystal growth should not be quenched, as a dramatic, sudden change in conditions can lead to defects, even in nanocrystals. Data should be collected when the crystals have reached their optimal size, but while this is highly desirable, it is not practical.

For all methods mentioned earlier, crystal growth must still be quenched to prevent them becoming too large, as the diffusion of protein will eventually allow them to continue growing. Crystal growth must be quenched as soon as they reach the desired size distribution, which requires regular monitoring of the size by DLS, visualization with SONICC and optical imaging. For example, if the crystals are grown in a 15% PEG2000 precipitant, then they should be quenched in a 20% PEG2000 solution to prevent further growth.

Crystal growth is typically quenched after they reach the desired size as monitored by optical microscopy and DLS. To quench crystal growth as much supernatant is removed as possible and a high concentration precipitation buffer containing 20% PEG2000 is added on top for crystal storage. These quenched crystals are best used within 2–5 days. A word of caution must be included about transport of crystals. While the crystals maintain their size distribution for days in a laboratory setting where they are stored without vibration at 10°C, they can dramatically change their size distribution during transport in favour of larger crystals. The reason is that even under quenched conditions there is an equilibrium between protein in solution and in the crystals, where proteins on the surface dissolve while proteins in solution can bind to the surface of the crystal. The surface/volume ratio is much higher for nanocrystals than for micrometre-sized crystals, leading to a net transfer of protein from the small to the larger crystals. This process is very slow under diffusion and/or convection controlled conditions when the crystal suspension is stored with minimal vibration. However, vibration and shaking cannot be avoided during transport by air and on land, leading to changes in the size distribution in the worst-case scenario, most of the small crystals completely dissolve and the remaining crystals are too large for data collection. Therefore, crystallization at the site of data collection is extremely important for the successful growth of well-ordered nano- and microcrystals for SFX.

3. Perbincangan

(a) Batch method

While the batch technique produces large quantities of small crystals, they are suboptimal for SFX as there is an indication that crystallization occurs too rapidly, producing low-quality crystals which are not ideal for X-ray diffraction. Also this technique offers no size control crystal size can range anywhere from less than 1 µm to 300 μm. This is a definite problem for SFX because crystal size should be limited to <4 μm, corresponding to the diameter of the liquid jet [18,19] as described in §2c(i). However, there are other sample delivery techniques, including the use of the new injector developed for crystals in lipidic cubic phases [21]. This slow running jet is ideal for many SFX experiments as it requires less sample and features a much larger jet, where crystals up to 30 µm in size can be delivered. However, the slow running jet is problematic for TR-SFX experiments. Another jet type has been reported by Bogan and co-workers [20] which is based on electrospinning and also allows for the use of larger crystals however, not all crystals may survive this procedure and the hit rates reported for use of this injector are very low.

(b) Free interface diffusion

This technique has several advantages over the batch technique, primarily the ability to control the size of the crystals grown. This could be because the nucleation and growth occur at the interface and are held by the high density of the underlaying precipitation buffer. Once the crystals achieve a certain size, depending upon the protein and the precipitation buffer, they will sink through the precipitation buffer and form a pellet. At this stage, crystal growth stops because lack of protein in the surrounding environment limits crystal size.

(c) Free interface diffusion centrifugation

The major difference between this technique and FID becomes apparent when comparing results obtained using a swinging bucket or fixed angle centrifuge rotor. When using a swinging bucket rotor, the crystals form a pellet at the bottom of the centrifuge tube where there is no protein but only high precipitant which immediately quenches crystal growth. When using a fixed angle rotor, the crystals coat the sides of the walls away from the centripetal force, causing a gradient in crystal sizes. Larger crystals are found towards the top of the microcentrifuge tube and smaller crystals are found towards the bottom, probably because the crystals at the top of the pellet are exposed to the mixing zone for longer and therefore acquire more protein, resulting in larger crystals.

Advantages of this technique are twofold: the first is the increased speed with which crystallization occurs. Rather than taking 24 h, a comparable yield can be achieved in approximately 30 min. The second advantage is that the crystals are much smaller, typically 0.5–2 μm.

4. Kesimpulan

We have presented several methods for nanocrystal growth. These have been tested primarily using PSII as a model protein for large unit cell membrane proteins. These techniques require a higher density precipitant to be used in the crystallization process, and many proteins are crystallized in various PEGs and other high-density media. For cases in which the protein is denser than its precipitant, this process can be reversed, with the precipitant being added to the protein. The crystallization techniques presented here have been verified on other proteins to demonstrate the generality of the method therefore we are confident that these techniques can be used for the growth of nano- or microcrystals for SFX experiments.

Funding statement

We acknowledge support by the Center for Bio-Inspired Solar Fuel Production, an Energy Frontier Research Center funded by the US Department of Energy, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences under Award Number DE-SC0001016 , which supported the work of Raimund Fromme and Shatabdi Roy-Chowdhury as well as part of work of Chelsie Conrad and paid for part of the summer salary devoted to this project for Petra Fromme. This work was supported by the National Institutes of Health Common Fund in Structural Biology grant R01 GM095583 , the National Institute of General Medical Sciences PSI:Biology grants U54 GM094599 as well as the National Science Foundation grant MCB-1021557 which supported the work of Christopher Kupitz. Recent support for participation of the work of Chelsie Conrad as well as support for publication costs from the NSF BioXFEL Science and Technology Center award no. 1231306 is acknowledged.


Tonton videonya: Efficient methods for fast, producible, C-Phycocyanin from Thermosynechococcus elongatus (Januari 2022).