Maklumat

Mengapa sel memerlukan siRNA?


Soalan saya adalah mengenai RNA bukan pengekodan kecil. miRNA dan siRNA keduanya terkenal dengan peraturan mRNA. miRNA boleh menghalang dan menurunkan mRNA secara transkrip dengan memotongnya. Untuk perencatan hanya serpihan kecil (benih) miRNA yang melengkapi mRNA sementara untuk penurunan miRNA dan mRNA mesti mencapai 100% padanan. siRNA adalah molekul yang hampir sama dan satu-satunya fungsinya 100% sepadan dengan mRNA dan menurunkannya.

Oleh itu, jika siRNA nampaknya hanya subtipe miRNA, bolehkah kita mengesahkannya? Atau adakah perbezaan lain yang menjadikan kedua molekul ini berlainan jenis RNA bukan pengekodan kecil?


Oleh itu, jika siRNA nampaknya hanya subtipe miRNA, bolehkah kita mengesahkannya? Atau adakah perbezaan lain yang menjadikan kedua molekul ini berlainan jenis RNA bukan pengekodan kecil?

siRNA dan miRNA tidak serupa, tetapi serupa. Tidak salah untuk menganggap mereka fenomena serupa dalam biologi, tetapi sejarah meletakkannya terpisah dan terdapat perbezaan kecil. Kedua-duanya diproses di dalam sel oleh enzim Dicer dan dimasukkan ke dalam kompleks RISC di mana sasarannya terdegradasi ("gangguan RNA"). Walau bagaimanapun, terdapat perbezaan penting, sekiranya anda mahu benar-benar betul.

siRNA biasanya bersifat eksogen (diperkenalkan dari luar oleh virus atau oleh kejuruteraan). Ini biasanya 100% percuma untuk mRNA sasarannya, kerana kami ingin mengurangkan pengikatan di luar sasaran. Jika dirancang dengan baik, mereka hanya menargetkan sasaran yang dimaksudkan dan diperiksa agar tidak sesuai dengan sasaran mRNA yang berpotensi lainnya, yaitu dirancang untuk menjadi spesifik.

miRNA bersifat endogen (berlaku secara semula jadi dalam sel) dan terdampar tunggal dalam vivo. Pemberian percuma tidak selalu sempurna 100%, dan sering mempunyai pelbagai sasaran. Ini adalah perbezaan utama antara keduanya. Ia berpasangan dengan mRNA sasarannya dengan tidak sempurna; ia hanya menghalang terjemahan (penghasilan protein dari mRNA). Dalam kes yang jarang berlaku di mana ia sesuai, ia menyebabkan pembelahan dan pemusnahan mRNA sasaran seperti siRNA. Sekiranya saya ingat dengan betul, tanaman miRNA, berbeza dengan miRNA haiwan, biasanya mempunyai pelengkap sempurna dengan sasarannya. miRNA juga berasal dari produk RNA stemloop yang lebih pendek daripada siRNA.

Seperti yang mungkin anda ketahui, kedua-duanya adalah RNA bukan pengekodan dan tidak memasukkan ribosom untuk terjemahan. Mereka mempunyai kesan yang sama terhadap ekspresi gen. Sekiranya anda berminat dengan laporan pertama mengenai salah satu jenis RNA, berikut:

miRNA ditemui pada tahun 1993 di cacing.

siRNA ditemui pada tahun 1999 di tumbuh-tumbuhan.

Perhatikan frasa RNA antisense dalam kedua-dua tajuk tersebut. Menarik!

Bacaan lebih lanjut, sekiranya anda berminat.

Mengapa sel memerlukan siRNA?

Ini adalah soalan yang sangat berbeza. Kenapa? Mungkin untuk memperhalusi ungkapan gennya. Spesies RNA kecil dapat mengumpulkan, mengagregat, dan mengatur tahap mRNA dengan cara yang mungkin tidak mungkin dilakukan di dalam nukleus pada tahap transkripsi DNA. RNA kecil juga difahami sebagai epigenetik dan berfungsi dalam retikulum sitoplasma dan endoplasma!


SiRNA dan Bagaimana Ia Digunakan

Opabinia regalis / Wikimedia Commons

siRNA, yang bermaksud Asid Ribonukleik yang mengganggu kecil, adalah kelas molekul RNA untai dua. Kadang-kadang ia dikenali sebagai RNA gangguan pendek atau membungkam RNA.

RNA gangguan kecil (siRNA) adalah kepingan kecil RNA untai ganda (ds), biasanya kira-kira 21 nukleotida panjang, dengan 3 '(diucapkan tiga prima) overhang (dua nukleotida) di setiap hujung yang dapat digunakan untuk "mengganggu" dengan terjemahan protein dengan mengikat dan mempromosikan degradasi messenger RNA (mRNA) pada urutan tertentu.


Ribosom membersihkan jalan untuk penargetan siRNA

Memvisualisasikan penargetan siRNA dari mRNA tunggal dalam sel hidup menunjukkan bahawa melewati ribosom untuk sementara melancarkan mRNA, memperlihatkannya kepada pengakuan siRNA. Kesan ini disebabkan oleh penyusunan semula perlahan banyak interaksi suboptimal yang lemah dalam mRNA.

RNA gangguan pendek (siRNA) membungkam ungkapan gen asing dengan memasangkan pangkalan dengan tapak pelengkap dalam transkrip RNA dalam proses yang dikenali sebagai gangguan RNA (RNAi) 1. Oleh kerana kemampuan mereka untuk mengurangi ekspresi gen tertentu, siRNA telah direkayasa untuk aplikasi bioteknologi dan potensi terapi mereka. Tapak sasaran siRNA sering ditutup dengan struktur sekunder mRNA, menjadikan senyap tidak efisien 2,3,4. Pemerhatian ini menimbulkan persoalan bagaimana mRNA dapat diakses oleh siRNA dan faktor peraturan lain. Dalam terbitan ini Biologi Molekul Struktur & amp; Alam, Ruijtenberg et al. 5 jawab soalan ini dengan mengukur secara langsung kinetik penargetan siRNA individu mRNA dalam sel hidup. Hebatnya, mereka mendapati siRNA bertindak lebih berkesan apabila mRNA diterjemahkan secara aktif dan menunjukkan bahawa ribosom yang lewat mengurangkan kesan penyamaran struktur sekunder mRNA. Lebih-lebih lagi, berdasarkan perubahan aksesibiliti lokasi sasaran dari masa ke masa, penulis dengan bijak menganggarkan kinetik lipat mRNA in vivo, memberikan maklumat baru mengenai jenis struktur yang dibentuk oleh urutan pengekodan mRNA.


Mematikan gen barah

Dalam 40 tahun kebelakangan ini, para saintis telah mempelajari banyak perkara mengenai bagaimana sel menjadi barah. Sebilangan pengetahuan itu telah diterjemahkan kepada rawatan baru, tetapi kebanyakan doktor terpaksa bergantung pada kemoterapi dan radiasi standard, yang dapat menyebabkan kerosakan pada pesakit seperti yang mereka lakukan pada tumor. Seri ini melihat rawatan yang disasarkan di kaki langit, dan apa yang perlu dilakukan untuk menjadikannya kenyataan.

Sel barah tunggal boleh menyimpan puluhan atau ratusan gen mutan. Sebilangan daripada gen tersebut memerintahkan sel tumbuh besar secara tidak normal, yang lain menyuruhnya membelah berulang kali atau melepaskan diri dan berkeliaran di badan mencari rumah baru.

Bagaimana jika anda dapat mematikan satu, dua atau bahkan selusin gen itu, sekaligus? Beberapa saintis percaya bahawa mereka akan segera dapat melakukan hal itu melalui gangguan RNA, proses semula jadi yang berlaku di dalam sel. Profesor Institut MIT Phillip Sharp menyebutnya sebagai salah satu rawatan barah baru yang paling menjanjikan dalam pembangunan.


Struktur RNA polimerase II
Imej: David Bushnell, Ken Westover dan Roger Kornberg, Universiti Stanford

Agar sel memenuhi nasib genetiknya, maklumat mesti dibawa dari DNA di nukleus ke ribosom, bahagian sel di mana protein dibuat. Gangguan RNA mengganggu aliran ini melalui potongan bahan genetik, yang dikenali sebagai siRNA (RNA gangguan pendek). SiRNA mengikat molekul RNA (mRNA) messenger, memusnahkan mRNA sebelum dapat menyampaikan arahan ke ribosom.

"Ia menawarkan potensi untuk mematikan gen pada sel," kata Daniel Anderson, ahli David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research MIT. Ini bererti para saintis boleh mencuba mematikan gen yang menyebabkan sel barah menjadi lemah, tumbuh di luar kawalan dan membebaskan diri dari kekangan biasa untuk melakukan perjalanan ke seluruh badan untuk memulakan tumor baru.

"Ini adalah gambaran teori yang hebat," kata Sharp, yang bekas postdoc, Andrew Fire, memenangi Hadiah Nobel dengan Craig Mello pada tahun 2006 kerana menemui gangguan RNA. Pertanyaannya adalah, "bisakah anda mengubahnya dari teori menjadi kenyataan?" Dia percaya jawapannya adalah ya, selagi satu cabaran teknikal utama dapat diselesaikan: bagaimana dengan selamat dan berkesan memberikan dos besar siRNA kepada tumor, sambil mengelakkan tisu yang sihat.

Penghantaran, penghantaran, penghantaran

Mendapatkan RNA ke dalam sel bukanlah tugas yang mudah. RNA adalah molekul besar yang bermuatan negatif - jenis yang selalunya cuba dijauhkan oleh sel. Para saintis dapat menyelipkan siRNA melalui membran sel dengan membungkusnya dalam molekul lain untuk menyamarkan cas negatifnya, tetapi begitu di dalam, RNA harus dilepaskan dari lapisannya.

Pengiriman adalah "rintangan nombor satu" menghadapi gangguan RNA, atau RNAi, kata Steven Dowdy, profesor perubatan molekul di University of California, San Diego. "Sekiranya anda tidak dapat menyampaikannya, itu tidak akan berjaya."

Enam tahun yang lalu, Dowdy - yang merupakan rakan pasca doktoral di Institut Whitehead pada awal 1990-an - menghentikan penyelidikannya mengenai penyampaian protein penekan tumor untuk meneruskan RNAi sebagai terapi barah. "Tidak ada yang dapat dibandingkan dengan potensi RNA," katanya. "Masalah dengan setiap ubat yang digunakan untuk melawan barah hari ini adalah tidak dapat disesuaikan. Dengan siRNA, anda boleh menyesuaikan ubat tersebut kerana barahnya sedang berkembang. "

Dia membayangkan bahawa dalam 10 atau 20 tahun, doktor akan dapat mengurutkan tumor pesakit individu untuk melihat gen penyebab barah mana yang telah diaktifkan, kemudian menyampaikan siRNA khusus untuk gen tersebut. Proses ini dapat diulang dengan sel-sel barah yang bertahan pada pusingan pertama, mengubah barah menjadi keadaan yang dapat dikendalikan.

Sekarang ini, salah satu calon terkemuka untuk penyampaian RNAi adalah sejenis molekul lemak yang disebut lipidoid, yang dapat bergabung dengan membran sel dengan mudah dan memasukkan muatan RNA ke dalamnya.

Anderson, Profesor Institut MIT Robert Langer dan yang lain di makmal mereka telah mengembangkan lipidoid penyampaian RNA yang dapat mematikan 10 gen sekaligus di hati tikus. Mereka juga berjaya mensasarkan kanser ovari. Dalam kajian yang diterbitkan tahun lalu di Prosiding Akademi Sains Nasional, Anderson dan rakan-rakannya menunjukkan bahawa dengan mematikan gen yang disebut claudin-3 pada tikus dengan tumor ovari, mereka secara dramatik dapat mengurangkan pertumbuhan tumor dan metastasis.

Ujian klinikal dengan lipidoid baru mungkin sekurang-kurangnya setahun lagi, kata Anderson, kerana pasukan itu perlu melakukan beberapa kajian haiwan tambahan, dan memerlukan dana untuk menghasilkan zarah dalam skala besar.

Lipidoid menyelesaikan dua masalah utama - memasukkan RNA ke dalam sel dan kemudian melepaskan RNA setelah ia berada di dalamnya, tetapi masih ada masalah yang harus diselesaikan, kata Dowdy. Zarah-zarah lipidoid sangat besar berbanding molekul RNA yang mereka sampaikan, yang dapat menghalangi kemampuan mereka masuk ke kapilari kecil dan mencapai sel tumor. "Ia seperti menghantar selusin telur dalam trak 18 roda," katanya. "Ini berfungsi dengan baik untuk melindungi telur, tetapi pada suatu saat Anda harus dapat turun ke beberapa jalan samping perumahan."

Menurunkan ketumbuhan

Sebaiknya, terapi RNAi yang berpotensi hanya akan memasuki sel barah dan mengelakkan sel yang sihat. Untuk membantu RNA tidak ada pada sel tumor, para penyelidik sedang menyiasat cara untuk menaburkan permukaan lipidoid (atau pembawa RNA lain) dengan protein yang mengikat molekul yang ditunjukkan dalam jumlah besar pada sel tumor tetapi bukan sel yang sihat. Sasaran yang berpotensi termasuk protein yang disebut p32, yang terlibat dalam metabolisme sel tumor, dan reseptor folat, yang membantu sel tumor mendapatkan folat yang mereka perlukan untuk menghasilkan DNA baru dengan cepat ketika mereka membelah.

Menggunakan RNAi untuk mensasarkan organ secara khusus seperti hati dapat membantu mengelakkan beberapa kesan sampingan yang biasanya dilihat dengan ubat barah tradisional, kata Stuart Pollard, naib presiden strategi saintifik dan perniagaan di Alnylam, sebuah syarikat yang diasaskan oleh Profesor Sharp dan MIT David Bartel di 2002 untuk mengikuti terapi RNAi.

Tahun lalu, Alnylam memulakan ujian klinikal Tahap I pada pesakit barah hati untuk rawatan RNAi yang mensasarkan dua gen - faktor pertumbuhan endotel vaskular (VEGF), yang membolehkan tumor merangsang pertumbuhan bekalan darah mereka sendiri, dan protein spindle kinesin, yang merupakan kritikal untuk pembahagian sel.

"Mereka sangat disasarkan ke hati, yang seharusnya memungkinkan mereka menghindari jaringan lain seperti usus dan sistem kekebalan tubuh," yang sering dirosakkan oleh ubat barah, kata Pollard. Hasil awal percubaan, yang dirancang untuk menguji keselamatan ubat, bukan keberkesanan, menunjukkan bahawa pesakit bertoleransi dengan baik.

Di makmal Sharp, para penyelidik sedang mengusahakan RNAi untuk mematikan gen untuk PARP1, enzim yang terlibat dalam jalan pembaikan DNA yang biasa digunakan oleh sel barah ovari dengan mutasi BRCA1. Mereka juga menargetkan mRNA yang memberi kod untuk bentuk varian enzim piruvate kinase, yang diyakini penting untuk metabolisme sel tumor.

Sharp, yang juga anggota Institut Koch, optimis bahawa dengan usaha yang cukup, cabaran teknikal yang ditimbulkan oleh RNAi dapat diatasi. "Sekiranya masalah itu dilihat cukup penting, kami akan dapat menyelesaikannya," katanya.


Rujukan

Dunoyer, P. et al. Dupleks RNA kecil berfungsi sebagai isyarat senyap bergerak antara sel tumbuhan. Sains 328, 912–916 (2010). Menunjukkan untuk pertama kalinya bahawa dupleks siRNA 21-nt-panjang bertanggungjawab untuk RNAi merebak pada jarak dekat di tanaman.

Molnar, A. et al. RNA senyap kecil pada tumbuhan adalah modifikasi epigenetik bergerak dan langsung pada sel penerima. Sains 328, 872–875 (2010). Menunjukkan kombinasi cantuman dan penjujukan mendalam yang elegan, yang menunjukkan bahawa siRNA sepanjang 24-nt bertanggungjawab untuk menyebarkan kesan RNAi pada jarak jauh melalui floem.

Dunoyer, P. et al. Jalur RNAi endogen, sistemik pada tumbuh-tumbuhan. EMBO J. 29, 1699–1712 (2010).

Melnyk, C. W., Molnar, A., Bassett, A. & amp Baulcombe, D. C. Bergerak RNA kecil 24 nt langsung membungkam gen transkripsional dalam meristem akar Arabidopsis thaliana. Curr. Biol. 21, 1678–1683 (2011).

Winston, W. M., Molodowitch, C. & amp Hunter, C. P. RNAi sistemik di C. elegans memerlukan protein transmembran putatif SID-1. Sains 295, 2456–2459 (2002). Pencirian molekul pertama a C. elegans protein yang diperlukan secara khusus untuk penyebaran RNAi.

Voinnet, O., Lederer, C. & amp Baulcombe, D. C. Protein pergerakan virus menghalang penyebaran isyarat membungkam gen di Nicotiana benthamiana. Sel 103, 157–167 (2000). Menunjukkan bahawa virus telah berkembang mekanisme untuk menargetkan RNA bergerak, sehingga menunjukkan fungsi penting untuk RNAi bergerak dalam pertahanan antivirus.

Carlsbecker, A. et al. Pemberian isyarat sel oleh microRNA165 / 6 mengarahkan nasib sel akar yang bergantung kepada dos. Alam semula jadi 465, 316–321 (2010). Menunjukkan mobiliti miRNA jarak pendek pada tumbuhan dan ia berperanan dalam menentukan perkembangan akar.

Ashe, A. et al. piRNA boleh mencetuskan ingatan epigenetik multigenerasi di garis pusat C. elegans. Sel 150, 88–99 (2012).

Shirayama, M. et al. piRNA memulakan ingatan epigenetik RNA sendiri di C. elegans garis kuman. Sel 150, 65–77 (2012).

Buckley, B. A. et al. Argonaute nuklear mempromosikan warisan epigenetik multigenerasi dan keabadian kuman. Alam semula jadi 489, 447–451 (2012). Menunjukkan, bersama dengan rujukan 8 dan 9, bahawa piRNA dan RNAi mendorong penyenyapan epigenetik transgenerasi dalam C. elegans.

Weiberg, A. et al. RNA kecil kulat menekan imuniti tumbuhan dengan merampas laluan gangguan RNA inang. Sains 342, 118–123 (2013). Melaporkan pemindahan RNA kecil antara spesies.

Palauqui, J. C., Elmayan, T., Pollien, J. M. & amp Vaucheret, H. Pembunyian yang diperoleh secara sistemik: penyenyapan pasca transkripsi khusus transgene ditransmisikan dengan mencantum dari stok yang disenyapkan ke sion yang tidak disenyapkan. EMBO J. 16, 4738–4745 (1997).

Voinnet, O., Vain, P., Angell, S. & amp Baulcombe, D. C. Penyebaran sistematik degradasi RNA transgene spesifik urutan pada tumbuh-tumbuhan dimulakan dengan pengenalan DNA tanpa promoter ektopik secara tempatan. Sel 95, 177–187 (1998).

Voinnet, O. & amp Baulcombe, D. C. Isyarat sistemik dalam membungkam gen. Alam semula jadi 389, 553 (1997).

Hamilton, A., Voinnet, O., Chappell, L. & amp Baulcombe, D. Dua kelas RNA gangguan pendek dalam membungkam RNA. EMBO J. 21, 4671–4679 (2002).

Brosnan, C. A. & amp Voinnet, O. Pergerakan siRNA sel ke sel dan jarak jauh di tumbuh-tumbuhan: mekanisme dan implikasi biologi. Curr. Pendapat. Tumbuhan Biol. 14, 580–587 (2011).

Dunoyer, P., Himber, C., Ruiz-Ferrer, V., Alioua, A. & amp Voinnet, O. gangguan RNA intra- dan antar sel dalam Arabidopsis thaliana memerlukan komponen jalur senyap mikroRNA dan heterokromatik. Genetik Alam. 39, 848–856 (2007).

Smith, L. M. et al. Protein SNF2 yang berkaitan dengan membungkam RNA nuklear dan penyebaran isyarat senyap antara sel di Arabidopsis. Sel Tumbuhan 19, 1507–1521 (2007).

Buhtz, A., Springer, F., Chappell, L., Baulcombe, D. C. & amp Kehr, J. Pengenalan dan pencirian RNA kecil dari floem Brassica napus. Tumbuhan J. 53, 739–749 (2008).

Varkonyi-Gasic, E., Gould, N., Sandanayaka, M., Sutherland, P. & amp MacDiarmid, R. M. Pencirian mikroRNA dari epal (Malus domestica 'Royal Gala') tisu vaskular dan getah floem. BMC Plant Biol. 10, 159 (2010).

Molnar, A., Melnyk, C. & amp Baulcombe, D. C. Membungkam isyarat dalam tumbuhan: perjalanan panjang untuk RNA kecil. Genom Biol. 12, 215 (2011).

Melnyk, C. W., Molnar, A. & amp Baulcombe, D. C. Pergerakan antara sel dan sistemik isyarat membungkam RNA. EMBO J. 30, 3553–3563 (2011).

Zhou, G.-K., Kubo, M., Zhong, R., Demura, T. & amp Ye, Z.-H. Ekspresi berlebihan miR165 mempengaruhi pembentukan meristem apikal, pembentukan polaritas organ dan pengembangan vaskular di Arabidopsis. Fisiol Sel Tumbuhan. 48, 391–404 (2007).

Miyashima, S., Koi, S., Hashimoto, T. & amp Nakajima, K. MikroRNA165 tanpa autonomi sel bertindak secara bergantung kepada dos untuk mengatur status pembezaan berganda di Arabidopsis akar. Pembangunan 138, 2303–2313 (2011).

Pant, B. D., Buhtz, A., Kehr, J. & amp Scheible, W.-R. MicroRNA399 adalah isyarat jarak jauh untuk peraturan homeostasis fosfat tumbuhan. Tumbuhan J. 53, 731–738 (2008).

Lin, S.-I. et al. Rangkaian peraturan mikroRNA399 dan PHO2 dengan isyarat sistemik. Fisiol Tumbuhan. 147, 732–746 (2008).

Kebakaran, A. et al. Gangguan genetik yang kuat dan spesifik oleh RNA untai ganda di Caenorhabditis elegans. Alam semula jadi 391, 806–811 (1998). Demonstrasi pertama RNAi di C. elegans , yang sudah memberikan bukti yang jelas bahawa RNAi secara sistematik menyebar ke seluruh organisma.

Timmons, L. & amp Fire, A. Gangguan khusus dengan menelan dsRNA. Alam semula jadi 395, 854 (1998). Penemuan bahawa C. elegans dapat menelan dsRNA dan memprosesnya untuk membungkam gen endogen.

Timmons, L., Court, D. L. & amp Fire, A. Pengambilan dsRNA yang dinyatakan secara bakteria dapat menghasilkan gangguan genetik yang spesifik dan kuat dalam Caenorhabditis elegans. Gen 263, 103–112 (2001).

Hinas, A., Wright, A. J. & amp Hunter, C. P. SID-5 adalah protein yang berkaitan dengan endosom yang diperlukan untuk RNAi sistemik yang cekap dalam C. elegans. Curr. Biol. 22, 1938–1943 (2012).

Winston, W. M., Sutherlin, M., Wright, A. J., Feinberg, E. H. & amp Hunter, C. P. Caenorhabditis elegans SID-2 diperlukan untuk gangguan RNA persekitaran. Pro. Natl Acad. Sains. USA 104, 10565–10570 (2007). Mengenal pasti protein saluran yang bertanggungjawab untuk pengambilan dsRNA dari persekitaran dengan C. elegans.

Jose, A. M., Kim, Y. A., Leal-Ekman, S. & amp Hunter, C. P. tirosin kinase yang dipelihara mempromosikan import membungkam RNA ke dalam Caenorhabditis elegans sel. Pro. Natl Acad. Sains. USA 109, 14520–14525 (2012).

Feinberg, E. H. & amp Hunter, C. P. Pengangkutan dsRNA ke dalam sel oleh protein transmembran SID-1. Sains 301, 1545–1547 (2003).

Shih, J. D., Fitzgerald, M. C., Sutherlin, M. & amp Hunter, C. P. Pengangkut RNA untai berkembar SID-1 tidak selektif untuk panjang dsRNA. RNA 15, 384–390 (2009).

Saleh, M.-C. et al. Laluan endosit memediasi kemasukan sel dsRNA untuk mendorong penyenyapan RNAi. Sel Alam Biol. 8, 793–802 (2006).

Jose, A. M., Garcia, G. A. & amp Hunter, C. P. Dua kelas membungkam RNA bergerak di antara Caenorhabditis elegans tisu. Struktur Alam. Mol. Biol. 18, 1184–1188 (2011).

Parrish, S. & amp Fire, A. Peranan berbeza untuk RDE-1 dan RDE-4 semasa gangguan RNA dalam Caenorhabditis elegans. RNA 7, 1397–1402 (2001).

Tabara, H. et al. Gen rde-1, gangguan RNA, dan senyap transposon di C. elegans. Sel 99, 123–132 (1999).

Pak, J., Maniar, J. M., Mello, C. C. & amp Fire, A. Perlindungan dari penguatan feed-forward dalam mekanisme RNAi yang diperkuat. Sel 151, 885–899 (2012).

Aphasizhev, R. RNA uridylyltransferases. Sel. Mol. Kehidupan Sci. 62, 2194–2203 (2005).

McEwan, D. L., Weisman, A. S. & amp Hunter, C. P. Penggunaan RNA helai ganda ekstraselular oleh SID-2. Mol. Sel 47, 746–754 (2012).

Sundaram, P., Echalier, B., Han, W., Hull, D. & amp Timmons, L. Pengangkut kaset pengikat ATP diperlukan untuk gangguan RNA yang cekap dalam Caenorhabditis elegans. Mol. Biol. Cel. 17, 3678–3688 (2006).

Nuez, I. & amp Félix, M.-A. Evolusi kerentanan terhadap RNA terdampar dua kali ganda dalam nematoda Caenorhabditis. PLOS SATU 7, e29811 (2012).

Ibrahim, H. M. M. et al. Gen pasca transkripsi membungkam nematoda akar-simpul pada akar kacang soya yang berubah. Tamat Parasitol. 127, 90–99 (2011).

Maule, A. G. et al. Mata RNAi pada parasit nematoda. Tren Parasitol. 27, 505–513 (2011).

Baulcombe, D. RNA membungkam dalam tanaman. Alam semula jadi 431, 356–363 (2004).

Brodersen, P. & amp Voinnet, O. Kepelbagaian laluan RNA membungkam di tumbuh-tumbuhan. Tren Genet. 22, 268–280 (2006).

Bologna, N. G. & amp Voinnet, O. Kepelbagaian, biogenesis, dan aktiviti endogenous membungkam RNA kecil di Arabidopsis. Annu. Pendeta Plant Biol. 65, 473–503 (2014).

Havelda, Z., Hornyik, C., Crescenzi, A. & amp Burgyán, J. In situ pencirian Cymbidium Ringspot Tombusvirus yang disebabkan oleh penyenyapan gen posttranskrip yang disebabkan oleh jangkitan Nicotiana benthamiana. J. Virol. 77, 6082–6086 (2003).

Deleris, A. et al. Tindakan hierarki dan penghambatan protein seperti Dicer dalam pertahanan antivirus. Sains 313, 68–71 (2006).

Guo, H. S. & amp Ding, S. W. Protein virus menghalang aktiviti isyarat jarak jauh gen membungkam. EMBO J. 21, 398–407 (2002).

Hamera, S., Song, X., Su, L., Chen, X. & amp Fang, R. Penekan virus mosaik timun 2b mengikat RNA kecil yang berkaitan dengan AGO4 dan mengganggu aktiviti AGO4. Tumbuhan J. 69, 104–115 (2012).

Duan, C.-G. et al. Penindasan dari Arabidopsis Pemotongan ARGONAUTE1 yang dimediasi, penyenyapan RNA yang disebabkan oleh transgene, dan metilasi DNA oleh domain yang berbeza dari protein 2b virus Cucumber mozek. Sel Tumbuhan 24, 259–274 (2012).

Lu, R. et al. Replikasi virus haiwan dan pendiam antivirus yang dimediasi oleh RNAi di Caenorhabditis elegans. Alam semula jadi 436, 1040–1043 (2005).

Li, H., Li, W. X. & amp Ding, S. W. Induksi dan penekanan membungkam RNA oleh virus haiwan. Sains 296, 1319–1321 (2002).

Wilkins, C. et al. Gangguan RNA adalah mekanisme pertahanan antivirus di Caenorhabditis elegans. Alam semula jadi 436, 1044–1047 (2005).

Schott, D. H., Cureton, D. K., Whelan, S. P. & amp Hunter, C. P. Peranan antivirus untuk jentera gangguan RNA di Caenorhabditis elegans. Pro. Natl Acad. Sains. USA 102, 18420–18424 (2005).

Félix, M.-A. et al. Jangkitan semula jadi dan eksperimen nematoda Caenorhabditis oleh virus novel yang berkaitan dengan nodavirus. PLoS Biol. 9, e1000586 (2011).

Ashe, A. et al. Polimorfisme penghapusan di Caenorhabditis elegans Homolog RIG-I melumpuhkan virus RNA virus dan imuniti antivirus. eLife 2, e00994 (2013).

Duchaine, T. F. et al. Proteomik berfungsi mendedahkan ceruk biokimia C. elegans DCR-1 dalam beberapa jalur kecil-dimediasi RNA. Sel 124, 343–354 (2006).

Lu, R., Yigit, E., Li, W. X. & amp Ding, S. W. Helikase RNA seperti RIG-I memediasi antivirus RNAi ke hilir biogenesis siRNA virus di Caenorhabditis elegans. Pathog PLoS. 5, e1000286 (2009).

Rehwinkel, J. & amp Reis e Sousa, C. Pengesanan ketat: mendedahkan virus melalui penginderaan RNA. Sains 327, 284–286 (2010).

Corrêa, R. L., Steiner, F. A., Berezikov, E. & amp Ketting, R. F. Biogenesis siRNA yang diarahkan MicroRNA di Caenorhabditis elegans. Genetik PLoS. 6, e1000903 (2010).

Sarkies, P., Ashe, A., Le Pen, J., McKie, M. A. & amp Miska, E. A. Persaingan antara RNA kecil yang berasal dari virus dan endogen mengatur ekspresi gen dalam Caenorhabditis elegans. Genom Res. 23, 1258–1270 (2013).

Shivaprasad, P. V. et al. Superfamily mikroRNA mengatur pengulangan nukleotida laman web berulang-leukin kaya dan mRNA lain. Sel Tumbuhan 24, 859–874 (2012).

Marín-González, E. & amp Suárez-López, P. "Namun ia bergerak": isyarat sel ke sel dan jarak jauh oleh mikroRNA tumbuhan. Tumbuhan Sci. 196, 18–30 (2012).

Lee, H.-C. et al. C. elegans piRNA memediasi pengawasan transkrip garis kuman di seluruh genom. Sel 150, 78–87 (2012).

Seth, M. et al. The C. elegans Laluan CSR-1 AGO menangkis penyenyapan epigenetik untuk mempromosikan ekspresi gen kuman. Penipu Sel 27, 656–663 (2013).

Wedeles, C. J., Wu, M. Z. & amp Claycomb, J. M. Perlindungan ekspresi gen kuman oleh C. elegans Argonaute CSR-1. Penipu Sel 27, 664–671 (2013).

Tijsterman, M., May, R. C., Simmer, F., Okihara, K. L. & amp Plasterk, R. H. A. Gen diperlukan untuk gangguan RNA sistemik dalam Caenorhabditis elegans. Curr. Biol. 14, 111–116 (2004).

Zhang, C. et al. The Caenorhabditis elegans Kompleks RDE-10 / RDE-11 mengatur RNAi dengan mempromosikan penguatan siRNA sekunder. Curr. Biol. 22, 881–890 (2012).

Lee, R. C., Feinbaum, R. L. & amp Ambros, V. The C. elegans gen heterokronik lin-4 mengekod RNA kecil dengan pelengkap antisense ke lin-14. Sel 75, 843–854 (1993).

Zhang, H. & amp Fire, A. Z. Spesifikasi autonomi sel identiti temporal oleh Caenorhabditis elegans mikroRNA lin-4. Penipu Biol. 344, 603–610 (2010).

Heard, E. & amp Martienssen, R. A. Warisan Epigenetik Transgenerasi: Mitos dan Mekanisme. Sel 157, 95–109 (2014).

Law, J. A. & amp; Jacobsen, S. E. Membentuk, mengekalkan dan mengubah corak metilasi DNA pada tumbuhan dan haiwan. Genetik Pendeta Alam. 11, 204–220 (2010).

Gu, S. G. et al. Pengukuhan siRNA di Caenorhabditis elegans menghasilkan jejak metilasi histon H3 lisin 9 yang disasarkan mengikut urutan transgenerasi. Genetik Alam. 44, 157–164 (2012).

Slotkin, R. K. et al. Pengaturcaraan semula epigenetik dan penyenyapan RNA kecil unsur transposable dalam debunga. Sel 136, 461–472 (2009). Menunjukkan bahawa siRNA bergerak di tumbuh-tumbuhan mendorong penyenyapan transposon pada generasi akan datang.

Calarco, J. P. et al. Pemrograman semula metilasi DNA dalam debunga memandu warisan epigenetik melalui RNA kecil. Sel 151, 194–205 (2012).

Ibarra, C. A. et al. Demetilasi DNA aktif dalam sel pendamping tumbuhan menguatkan metilasi transposon dalam gamet. Sains 337, 1360–1364 (2012).

Henderson, I. R. & amp; Jacobsen, S. E. Pewarisan epigenetik dalam tanaman. Alam semula jadi 447, 418–424 (2007).

Grant-Downton, R. et al. MikroRNA buatan menunjukkan perbezaan spesifik sel dalam aktiviti RNA kecil dalam debunga. Curr. Biol. 23, R599 – R601 (2013).

Siomi, M. C., Sato, K., Pezic, D. & amp Aravin, A. A. RNA kecil berinteraksi PIWI: barisan hadapan pertahanan genom. Nature Rev. Mol. Sel Biol. 12, 246–258 (2011).

Das, P. P. et al. Piwi dan piRNA bertindak di hulu jalur siRNA endogen untuk menekan mobiliti transposon Tc3 di Caenorhabditis elegans garis kuman. Mol. Sel 31, 79–90 (2008).

Batista, P. J. et al. PRG-1 dan 21U-RNA berinteraksi untuk membentuk kompleks piRNA yang diperlukan untuk kesuburan di C. elegans. Mol. Sel 31, 67–78 (2008).

Bagijn, M. P. et al. Fungsi, sasaran, dan Eevolution of Caenorhabditis elegans piRNA. Sains 337, 574–578 (2012).

Luteijn, M. J. et al. Senyawa gen yang disebabkan oleh Piwi yang sangat stabil dalam Caenorhabditis elegans. EMBO J. 31, 3422–3430 (2012).

Alcazar, R. M., Lin, R. & amp Fire, A. Z. Dinamika penghantaran senyap yang diwariskan disebabkan oleh RNA untai dua Caenorhabditis elegans. Genetik 180, 1275–1288 (2008).

Zhuang, J. J., Banse, S. A. & amp Hunter, C. P. Argonaute nuklear NRDE-3 menyumbang kepada RNAi transitif di Caenorhabditis elegans. Genetik 194, 117–131 (2013).

Jalur Sarkies, P. & amp Miska, E. A. RNAi dalam pengiktirafan RNA asing: tindak balas antivirus dan interaksi parasit inang dalam nematoda. Biokimia. Soc. Trans. 41, 876–880 (2013).

Sarkies, P. & amp Miska, E. A. Biologi molekul. Adakah terdapat RNA sosial? Sains 341, 467–468 (2013).

Zong, J., Yao, X., Yin, J., Zhang, D. & amp Ma, H. Evolusi gen RNA polimerase bergantung kepada RNA (RdRP): Penduaan dan kemungkinan kerugian sebelum dan selepas perbezaan kumpulan eukariotik utama . Gen 447, 29–39 (2009).

Turchinovich, A., Weiz, L. & amp Burwinkel, B. miRNA ekstraselular: misteri asal usul dan fungsi mereka. Biokem Trends. Sains. 37, 460–465 (2012).

Gibbings, D. J., Ciaudo, C., Erhardt, M. & amp Voinnet, O. Badan multivesikular bersekutu dengan komponen kompleks efektor miRNA dan memodulasi aktiviti miRNA. Sel Alam Biol. 11, 1143–1149 (2009).

Lee, Y. S. et al. Membungkam oleh RNA kecil dikaitkan dengan perdagangan endosom. Sel Alam Biol. 11, 1150–1156 (2009).

Gibbings, D. & amp Voinnet, O. Kawalan membungkam dan penyetempatan RNA oleh endolysosomes. Trends Cell Biol. 20, 491–501 (2010).

Yao, B., La, L. B., Chen, Y.-C., Chang, L.-J. & amp Chan, E. K. L. Mendefinisikan peranan baru GW182 dalam menjaga kestabilan miRNA. Perwakilan EMBO 13, 1102–1108 (2012).

Li, Y., Lu, J., Han, Y., Fan, X. & amp Ding, S. W. RNA gangguan berfungsi sebagai mekanisme imuniti antivirus pada mamalia. Sains 342, 231–234 (2013).

Maillard, P. V. et al. Gangguan RNA antivirus pada sel mamalia. Sains 342, 235–238 (2013).

Shapiro, E., Biezuner, T. & amp Linnarsson, S. Teknologi berasaskan penjujukan sel tunggal akan merevolusikan sains seluruh organisma. Genetik Pendeta Alam. 14, 618–630 (2013).

Okamura, K. & amp Lai, E. C. RNA kecil interogen pada haiwan. Nature Rev. Mol. Sel Biol. 9, 673–678 (2008).

Hutvagner, G. & amp Simard, M. J. Argonaute protein: pemain utama dalam membungkam RNA. Nature Rev. Mol. Sel Biol. 9, 22–32 (2008).

Pak, J. & amp Fire, A. Populasi yang berlainan dari efektor primer dan sekunder semasa RNAi di C. elegans. Sains 315, 241–244 (2007).

Olovnikov, I., Aravin, A. A. & amp Toth, K. F. RNA kecil dalam nukleus: ping-pong RNA-kromatin. Curr. Pendapat. Genet. Penipu 22, 164–171 (2012).

Henderson, I. R. et al. Membelah Arabidopsis thaliana Fungsi DICER dalam pemprosesan RNA kecil, membungkam gen dan corak metilasi DNA. Genetik Alam. 38, 721–725 (2006).

Xie, Z. et al. Kepelbagaian genetik dan fungsi laluan RNA kecil pada tumbuhan. PLoS Biol. 2, E104 (2004).

Zilberman, D. et al. Peranan Arabidopsis ARGONAUTE4 dalam metilasi DNA yang diarahkan RNA dipicu oleh pengulangan terbalik. Curr. Biol. 14, 1214–1220 (2004).

Kasschau, K. D. et al. Profil dan analisis seluruh genom Arabidopsis siRNA. PLoS Biol. 5, e57 (2007).

Papp, I. et al. Bukti untuk pemprosesan nuklear RNA mikro tumbuhan dan pendahuluan RNA gangguan pendek. Fisiol Tumbuhan. 132, 1382–1390 (2003).

Knight, S. W. & amp Bass, B. L. Peranan untuk enzim RNase III DCR-1 dalam gangguan RNA dan pengembangan garis kuman di Caenorhabditis elegans. Sains 293, 2269–2271 (2001).

Ketting, R. F. et al. Fungsi yang lebih baik dalam gangguan RNA dan dalam sintesis RNA kecil yang terlibat dalam masa pembangunan di C. elegans. Gen Dev. 15, 2654–2659 (2001).

Sijen, T., Steiner, F. A., Thijssen, K. L. & amp Plasterk, R. H. A. siRNA sekunder terhasil daripada sintesis RNA yang tidak dicas dan membentuk kelas yang berbeza. Sains 315, 244–247 (2007).

Fischer, S. E. J. et al. Heliksase ERI-6/7 bertindak pada tahap pertama jalur penguatan siRNA yang mensasarkan penduaan gen baru-baru ini. Genetik PLoS. 7, e1002369 (2011).

Gent, J. I. et al. Fasa sintesis siRNA yang berbeza dalam laluan RNAi endogen di C. elegans soma. Mol. Sel 37, 679–689 (2010).

Jablonka, E. & amp Lamb, M. J. Pewarisan lembut: mencabar sintesis moden. Genet. Mol. Biol. 31, 2 (2008).

Luna, E., Bruce, T. J. A., Roberts, M. R., Flors, V. & amp Ton, J. Rintangan memperoleh sistemik generasi seterusnya. Fisiol Tumbuhan. 158, 844–853 (2012).

Dowen, R. H. et al. Metilasi DNA dinamik yang meluas sebagai tindak balas terhadap tekanan biotik. Pro. Natl Acad. Sains. USA 109, E2183-2191 (2012).

Bond, D. M. & amp Baulcombe, D. C. RNA kecil dan variasi epigenetik yang boleh diturunkan dalam tumbuhan. Trends Cell Biol. 24, 100–107 (2014).


Mengapa plasmid linierisasi menjadikan transfeksi stabil? - (16 Mac / 2005)

apa yang benar-benar menjadikan transfeksi stabil atau sementara?
Terima kasih jika ada yang menjawab saya.

transfeksi sementara adalah proses di mana anda menyampaikan plasmid dalam sel dan menganalisis keadaan dua atau tiga hari kemudian.

Tetapi jika anda mahukan transfeksi yang stabil, anda perlu memilih sel-sel yang telah BERSEPADU dalam genomnya sebagai plasmid. Oleh itu, anda menambah tekanan pemilihan di media dan sel yang tidak berminat.

Umumnya, orang tidak melariskan plasmid sebelum transfeksi. Tetapi jika anda menginginkan lebih banyak keselamatan mengenai laman web di mana plasmid dibuka di dalam sel (langkah yang diperlukan untuk penyatuan dalam genom, plasmid dapat dijelaskan.

secara jujurnya saya tidak membuat penjelasan setiap kali sebelum transfeksi.

Untuk menindaklanjuti perbincangan ini lebih lanjut, ukuran plasmid dapat mempengaruhi kecekapan transfeksi, yang mempunyai implikasi untuk mewujudkan garis sel yang stabil.

Untuk rujukan yang baik, sila lihat Penyelidikan Asid Nukleik artikel oleh Kreiss et al yang menyiasat fenomena ini di http://nar.oupjournals.org/cgi/content/full/27/19/3792

(Catatan: Artikel ini juga merujuk pemerhatian mengenai tahap ekspresi gen yang dicapai menggunakan DNA supercoiled vs linearized.)

Kegiatan luciferase yang diukur dalam sel HeLa yang ditransfeksi (Gbr. 5) bergantung pada ukuran DNA plasmid, sama ada supercoiled atau linearized. Oleh itu, topologi molekul DNA yang dipindahkan menentukan tahap ekspresi gen tetapi molekul DNA kecil mempunyai kecekapan transfeksi yang lebih tinggi daripada yang lebih besar. Kecekapan transfeksi plasmid kecil yang lebih besar berbanding dengan plasmid yang lebih besar mungkin disebabkan oleh perbezaan dalam satu proses proses transfeksi yang berlaku setelah internalisasi partikel. Szoka et al. (29) baru-baru ini mengusulkan bahawa endositosis kompleks lipid kationik-DNA menstabilkan membran endosom, yang mengakibatkan perpindahan lipid kationik dari DNA dan pelepasan DNA seterusnya dalam sitoplasma. Behr et al. (30) juga berpendapat bahawa DNA dilepaskan dari lipid kationik dalam sitoplasma melalui pencampuran lipid dan pertukaran kompetitif dengan polimer anionik seperti mRNA sitoplasma. Berdasarkan laporan ini, kami mencadangkan bahawa ukuran DNA boleh berlaku sama ada mekanisme pembebasan DNA dari lipid kationik atau untuk penghijrahan DNA intraselullar dari sitoplasma ke nukleus, atau keduanya. & quot

Terima kasih banyak & # 33 Walaupun saya melariskan plasmid sebelum transfeksi ke sel induk embrio, banyak klon yang diperoleh baru mati di petikan No 3-10. Saya mengambil satu klon dan dibahagikan kepada dua kultur, satu dengan dan satu tanpa antibiotik pilihan (puromycin). Budaya tanpa puromycin cepat berkembang tetapi yang mempunyai puromycin mati. Oleh itu, saya tidak tahu mengapa walaupun saya mempunyai plasmid linier, kebanyakan transfektan tidak stabil? Mungkinkah sel-sel saya cuba menyingkirkan gen yang terintegrasi?

hai
jika sel anda dengan puromycin mati kerana ia tidak mengintegrasikan gen. Mungkin anda boleh membiarkan mereka mengintegrasikan gen untuk jangka masa yang lebih lama (dua / tiga hari)?

Saya melakukan transfeksi dengan elektropori dan 1 hari kemudian menambah media selectin. Selepas 7 hari klon kelihatan dan saya mengambil klon ini untuk kultur sel ES normal untuk mengambil sampel untuk analisis dan menyimpan sel-sel di dalam peti sejuk. Lebih banyak klon mati ketika saya memilih dengan kepekatan puromycin yang tinggi & # 33 Oleh itu, saya mempunyai soalan lain. Bolehkah peningkatan tekanan pemilihan ada kaitannya dengan ungkapan POI yang lebih tinggi? Oleh kerana saya dapat mengesan mRNA GOI tetapi tidak dapat mengesan protein oleh WB, seseorang menasihati saya untuk meningkatkan kepekatan puromycin. Saya tidak memahami rasional di sebalik perkara ini.

Terima kasih banyak untuk jawapan biasa & # 33
Thuy

mmmh, saya harap GOI dan POI adalah untuk gen / protein yang diminati

kerana puromycin dan GOI tidak berada di bawah penganjur yang sama, tidak ada hubungan langsung antara kedua-dua aktiviti transkripsi. Dengan cara terjemahan tidak dihubungkan secara langsung.
By increasing the puromycin concentration, you'll select cells that have a high expression of the puromycin gene. But you can't touch the expression of GOI. All you get is more clones dying and no effect on POI (non detected in WB, is it?)
What's your promoter?


MiRNA Resarch Product Offerings

It is quite clear that miRNA research has great promise and may be the backbone of many of the most cutting-edge medical therapies of tomorrow. To keep up with the growing interest in miRNA, we have made a strong commitment to this rapidly developing area of research and is in the process of developing a comprehensive product portfolio to our customers including miRNA isolation, amplification, profiling, and functional analysis. The mirPremier microRNA Isolation Kit complements the already robust MISSION ® RNAi product line which includes a broad choice of MISSION ® siRNA, MISSION ® miRNA mimics and shRNA products and services such as libraries, mRNA detection reagents, antibodies and AQUA™ peptides for protein level detection. An entire workflow of supporting reagents including cell culture, cell biology compounds and assays, transfection reagents, and much more).


Nanoparticles used to transport anti-cancer agent to cells

Cells with MOFs carrying siRNA. Credit: University of Cambridge

Scientists from the University of Cambridge have developed a platform that uses nanoparticles known as metal-organic frameworks to deliver a promising anti-cancer agent to cells.

Research led by Dr. David Fairen-Jimenez, from the Cambridge Department of Chemical Engineering and Biotechnology, indicates metal-organic frameworks (MOFs) could present a viable platform for delivering a potent anti-cancer agent, known as siRNA, to cells.

Small interfering ribonucleic acid (siRNA), has the potential to inhibit overexpressed cancer-causing genes, and has become an increasing focus for scientists on the hunt for new cancer treatments.

Fairen-Jimenez's group used computational simulations to find a MOF with the perfect pore size to carry an siRNA molecule, and that would breakdown once inside a cell, releasing the siRNA to its target. Their results were published today in Cell Press journal, Chem.

Some cancers can occur when specific genes inside cells cause over-production of particular proteins. One way to tackle this is to block the gene expression pathway, limiting the production of these proteins.

SiRNA molecules can do just that—binding to specific gene messenger molecules and destroying them before they can tell the cell to produce a particular protein. This process is known as 'gene knockdown'. Scientists have begun to focus more on siRNAs as potential cancer therapies in the last decade, as they offer a versatile solution to disease treatment—all you need to know is the sequence of the gene you want to inhibit and you can make the corresponding siRNA that will break it down. Instead of designing, synthesising and testing new drugs—an incredibly costly and lengthy process—you can make a few simple changes to the siRNA molecule and treat an entirely different disease.

One of the problems with using siRNAs to treat disease is that the molecules are very unstable and are often broken down by the cell's natural defence mechanisms before they can reach their targets. SiRNA molecules can be modified to make them more stable, but this compromises their ability to knock down the target genes. It's also difficult to get the molecules into cells—they need to be transported by another vehicle acting as a delivery agent.

Crystalline metal-organic framework. Credit: David Fairen-Jimenez

The Cambridge researchers have used a special nanoparticle to protect and deliver siRNA to cells, where they show its ability to inhibit a specific target gene.

Fairen-Jimenez leads research into advanced materials, with a particular focus on MOFs: self-assembling 3-D compounds made of metallic and organic building blocks connected together.

There are thousands of different types of MOFs that researchers can make—there are currently more than 84,000 MOF structures in the Cambridge Structural Database with 1000 new structures published each month—and their properties can be tuned for specific purposes. By changing different components of the MOF structure, researchers can create MOFs with different pore sizes, stabilities and toxicities, enabling them to design structures that can carry molecules such as siRNAs into cells without harmful side effects.

"With traditional cancer therapy if you're designing new drugs to treat the system, these can have different behaviours, geometries, sizes, and so you'd need a MOF that is optimal for each of these individual drugs," says Fairen-Jimenez. "But for siRNA, once you develop one MOF that is useful, you can in principle use this for a range of different siRNA sequences, treating different diseases."

"People that have done this before have used MOFs that don't have a porosity that's big enough to encapsulate the siRNA, so a lot of it is likely just stuck on the outside," says Michelle Teplensky, former Ph.D. student in Fairen-Jimenez's group, who carried out the research. "We used a MOF that could encapsulate the siRNA and when it's encapsulated you offer more protection. The MOF we chose is made of a zirconium based metal node and we've done a lot of studies that show zirconium is quite inert and it doesn't cause any toxicity issues."

Using a biodegradable MOF for siRNA delivery is important to avoid unwanted build-up of the structures once they've done their job. The MOF that Teplensky and team selected breaks down into harmless components that are easily recycled by the cell without harmful side effects. The large pore size also means the team can load a significant amount of siRNA into a single MOF molecule, keeping the dosage needed to knock down the genes very low.

"One of the benefits of using a MOF with such large pores is that we can get a much more localised, higher dose than other systems would require," says Teplensky. "SiRNA is very powerful, you don't need a huge amount of it to get good functionality. The dose needed is less than 5% of the porosity of the MOF."

Credit: University of Cambridge

A problem with using MOFs or other vehicles to carry small molecules into cells is that they are often stopped by the cells on the way to their target. This process is known as endosomal entrapment and is essentially a defence mechanism against unwanted components entering the cell. Fairen-Jimenez's team added extra components to their MOF to stop them being trapped on their way into the cell, and with this, could ensure the siRNA reached its target.

The team used their system to knock down a gene that produces fluorescent proteins in the cell, so they were able to use microscopy imaging methods to measure how the fluorescence emitted by the proteins compared between cells not treated with the MOF and those that were. The group made use of in-house expertise, collaborating with super-resolution microscopy specialists Professors Clemens Kaminski and Gabi Kaminski-Schierle, who also lead research in the Department of Chemical Engineering and Biotechnology.

Using the MOF platform, the team were consistently able to prevent gene expression by 27%, a level that shows promise for using the technique to knock down cancer genes.

Fairen-Jimenez believes they will be able to increase the efficacy of the system and the next steps will be to apply the platform to genes involved in causing so-called hard-to-treat cancers.

"One of the questions we get asked a lot is 'why do you want to use a metal-organic framework for healthcare?', because there are metals involved that might sound harmful to the body," says Fairen-Jimenez. "But we focus on difficult diseases such as hard-to-treat cancers for which there has been no improvement in treatment in the last 20 years. We need to have something that can offer a solution just extra years of life will be very welcome."

The versatility of the system will enable the team to use the same adapted MOF to deliver different siRNA sequences and target different genes. Because of its large pore size, the MOF also has the potential to deliver multiple drugs at once, opening up the option of combination therapy.


Sperma Sangat Beradaptasi untuk Menyampaikan DNA mereka ke Telur

Typical sperm are “stripped-down” cells, equipped with a strong flagellum to propel them through an aqueous medium but unencumbered by cytoplasmic organelles such as ribosomes, endoplasmic reticulum, or Golgi apparatus, which are unnecessary for the task of delivering the DNA to the egg. Sperm, however, contain many mitochondria strategically placed where they can most efficiently power the flagellum. Sperm usually consist of two morphologically and functionally distinct regions enclosed by a single plasma membrane: the tail, which propels the sperm to the egg and helps it to burrow through the egg coat, and the head, which contains a condensed haploid nucleus (Figure 20-25). The DNA in the nucleus is extremely tightly packed, so that its volume is minimized for transport, and transcription is shut down. The chromosomes of many sperm have dispensed with the histones of somatic cells and are packed instead with simple, highly positively charged proteins called protamines.

Figure 20-25

A human sperm. It is shown in longitudinal section.

In the head of most animal sperm, closely apposed to the anterior end of the nuclear envelope, is a specialized secretory vesicle called the acrosomal vesicle (see Figure 20-25). This vesicle contains hydrolytic enzymes that may help the sperm to penetrate the egg's outer coat. When a sperm contacts an egg, the contents of the vesicle are released by exocytosis in the so-called acrosome reaction in some sperm, this reaction also exposes or releases specific proteins that help bind the sperm tightly to the egg coat.

The motile tail of a sperm is a long flagellum, whose central axoneme emanates from a basal body situated just posterior to the nucleus. As described in Chapter 16, the axoneme consists of two central singlet microtubules surrounded by nine evenly spaced microtubule doublets. The flagellum of some sperm (including those of mammals) differs from other flagella in that the usual 9 + 2 pattern of the axoneme is further surrounded by nine outer dense fibers (Figure 20-26). These dense fibers are stiff and noncontractile, and it is not known what role they have in the active bending of the flagellum, which is caused by the sliding of adjacent microtubule doublets past one another. Flagellar movement is driven by dynein motor proteins, which use the energy of ATP hydrolysis to slide the microtubules, as discussed in Chapter 16. The ATP is generated by highly specialized mitochondria in the anterior part of the sperm tail (called the midpiece), where the ATP is needed (see Figures 20-25 and 20-26).

Figure 20-26

Drawing of the midpiece of a mammalian sperm as seen in cross section in an electron microscope. The core of the flagellum is composed of an axoneme surrounded by nine dense fibers. The axoneme consists of two singlet microtubules surrounded by nine microtubule (more. )


Remarkable RNA: Tales of a Genetic Messenger

RNA is best known as a messenger that carries genetic information, but this versatile molecule is involved in many other essential cellular functions, as well. Here’s a quick rundown of the types of RNA that scientists are discovering and learning more about with funding from the National Institutes of Health.

The Translators

These RNAs are involved in the fundamental process of translation, when the information in our genes is decoded and used to produce proteins.

Messenger RNA, or mRNA, transfers information held in genes to the ribosome, where cellular proteins are made. Each of our cells carries tens of thousands of different mRNAs, which give rise to a broad array of proteins.

Ribosomal RNA, or rRNA, is a part of the ribosome that plays a direct role in linking protein building blocks called amino acids. Humans have four kinds of rRNAs.

Transfer RNA, or tRNA, decodes the genetic information held in the mRNA and helps add amino acids to a growing protein chain. Scientists estimate that human cells have more than 500 different tRNAs.

The Regulators

Despite their small size, these RNAs have a huge impact on controlling the patterns of gene activity in our cells.

Small interfering RNA, or siRNA, is a piece of RNA that the cell snips from an invading virus or other threat and then uses to seek out and destroy the potentially deadly intruder. Because of their ability to target and inactivate specific segments of RNA, siRNAs have also become a powerful research tool for learning more about how genes function.

MicroRNA, or miRNA, is a tiny piece of cellular RNA that regulates protein production by binding to mRNA and blocking its ability to function. Scientists have uncovered hundreds of miRNAs in humans, and they estimate that miRNAs regulate more than half of our protein-coding genes.

Piwi-interacting RNA, or piRNA, is largely restricted to egg and sperm cells, unlike siRNA and miRNA, which function in many cell types. piRNAs help ensure the integrity of the important pool of DNA that gets transmitted to future generations by blocking roving genetic elements that can jump into genes and cause mutations.

Long intervening noncoding RNA, or lincRNA, appears to function as a scaffold for coordinating the activities of proteins that regulate gene activities. More than 8,000 lincRNAs are encoded in human DNA.

The Processors

Many RNA molecules need to be cut, pasted, trimmed or chemically modified before they can function. These RNAs are involved in processing other types of RNA, including many of the ones mentioned above, into their final forms.

Small nuclear RNA, or snRNA, teams up with a host of proteins to form the spliceosome, a complex that snips out extraneous segments of mRNA to make a fully functional molecule that can then code for a protein. Humans have five snRNAs, each with its own role in the process.

Small nucleolar RNA, or snoRNA, identifies the rRNA targets for the addition of a chemical group or for rearrangement. The modifications produce a functional rRNA molecule that works in the ribosome.

M1 RNA helps clip tRNAs in bacteria so that these molecules can decode genetic information. Its discovery made it a &ldquocelebrity&rdquo in the RNA world because it was the first time researchers had found evidence that RNA could act as a catalyst that controls and directs cellular functions. The scientist who made this discovery, Sidney Altman, won a Nobel Prize in 1989 along with Thomas Cech, who independently uncovered evidence for catalytic activity in RNA when he discovered a self-splicing RNA molecule.

Research on these and other RNAs has led scientists to a broader understanding of RNA’s critical role in many important cellular processes and of how impairments in these processes can lead to disease. Scientists are also harnessing RNA as a research tool and as the basis for new therapies for infections, cancer and other conditions.


Tonton videonya: siRNA. Short interfering RNA mechanism of RNA interference (Disember 2021).